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目的:利用同源重组制备副溶血弧菌vpa0961基因的突变株,通过构建重组质粒制备vpa0961基因突变回补株,运用表型实验和分子生物学实验,研究LysR型转录调节因子VPA0961对副溶血弧菌的生长及毒力相关表型,包括不同盐度条件下的生长曲线测定、动力、溶血活性、生物膜形成能力、小鼠致死毒性的影响,并探讨其对T3SS1基因vpoN、vpa1687和exsB、VP-PAI基因vopB2、tdh2、vtrA、以及T6SS2基因vpa1044的转录调控的作用机制,为进一步认识副溶血弧菌的致病机制提供相应的理论基础。方法:1.突变株构建:以副溶血弧菌RIMD2210633(WT)的基因组DNA为模板,PCR扩增得到vpa0961的同源臂融合片段,并克隆至自杀质粒pDS132多克隆位点中。将pDS132重组质粒转入WT中,通过同源重组的方法获得vpa0961突变株(Δvpa0961)。2.突变回补株构建:PCR扩增vpa0961的整个编码区序列,并将其直接克隆入pBAD33质粒中,获得重组回补质粒并导入突变株中,获取vpa0961突变回补株。3.细菌生长曲线绘制:将WT接种于HI肉汤,37℃下200rpm培养13h,每1h测定OD600一次,以时间为横座标,OD为纵座标绘制细菌的生长曲线。4.Swimming:分别取1.5μL的细菌预培养物,穿刺接种至swimming平板(1%Oxiodtrytone,2%NaCl和0.2%Difconobleagar)中,重复4次,37℃下静置培养2天后测量菌苔直径。5.Swarming:分别取2μL的细菌预培养物,接种至swarming平板(2.5%Bacto heartinfusion,1.5%NaCl和2.0%Difconobleagar)表面,重复4次,37℃下静置培养2天后测量菌苔直径。6.透明度检测:将WT和Δvpa0961分别接种至5ml的HI肉汤中,37℃250r/min,摇至OD600 1.2,各取1μL菌液接种于同一块HI板上,37℃倒置培养过夜,观察菌落透明度。7.结晶紫染色检测:在HI培养基中分别培养WT-pBAD33、Δvpa0961-pBAD33、及C-Δvpa0961至对数期,转种至96孔板,30℃条件下静置3天,洗去浮游细菌,用结晶紫对生物膜进行染色,然后用30%冰醋酸洗脱,595nm 比色测定。8.溶血活性检测:分别将WT、Δvpa0961和C-vpa0961点接至含有人O型红细胞的血琼脂平板上,37℃条件下静置培养,并根据各菌株菌苔在培养基表面所形成透明溶血圈的大小差异,判定VPA0961是否调控副溶血弧菌的溶血活性。9.小鼠致死毒性分析:以WT、Δvpa0961腹腔途径感染小鼠,以PBS作对照,通过绘制感染后小鼠生存曲线,判别细菌的小鼠致死毒性。10.HeLa细胞粘附能力检测:取等量WT-pBAD33,Δvpa0961-pBAD33及C-Δvpa0961菌株,分别加入等量的HeLa细胞预培养物中,在含5%CO2的孵箱中37℃条件下培养90min,然后用PBS洗涤细胞三次,用0.5%的曲拉通作用l0min,离心15min,弃去上清,用DMEM稀释沉淀至合适倍数后涂板计数,结果为粘附于HeLa细胞表面的细菌总数。11.qRT-PCR:将WT分别在含0.5%和4.0%NaCl的HI中37℃培养至不同生长时期,分别提取细菌总RNA,用qRT-PCR分析vpa0961基因表达特性。将提取WT、Δvpa0961在各种不同生长条件下的总RNA,用qRT-PCR分析各种靶基因在两种菌株中的表达差异。结果:1.qRT-PCR分析结果显示,副溶血弧菌在低盐条件下vpa0961基因表达水平明显高于在高盐条件下水平。2.特异性扩增及序列分析显示,vpa0961基因缺失株变异株(Δvpa0961)及突变回补株(C-Δvpa0961)构建成功。3.生长曲线测定结果显示,vpa0961突变株在低盐和高盐两种条件下的生长速度与野生株无明显差异。4.动力试验结果显示,与WT相比Δvpa0961游动力(swimming)和爬动力(swarming)明显减弱。5.菌落透明度试验表明,Δvpa0961与WT菌落在透明度上无明显差异。6.生物膜形成能力分析显示,Δvpa0961的生物膜形成能力相比WT明显下降。7.溶血活性、HeLa细胞粘附及小鼠致死毒性试验结果显示,与WT相比Δvpa0961的溶血活性下降,粘附HeLa细胞的能力下降,对小鼠致死毒性增强。8.qRT-PCR分析基因表达结果显示,VPA0961能上调极鞭毛基因flgM、flaB、flaF和侧鞭毛基因lafA、flgB、motY、fliD的表达,对生物膜形成相关基因sypG有正调控作用,对T3SS1基因vpoN、vpa1687和exsB的表达具有正调控作用,对Vp-PAI基因vopB2、tdh2、vtrA的表达具有负调控作用,对T6SS2基因vpa1044表达具有正调控作用。9.qRT-PCR分析结果显示,VPA0961和QS密度感应系统核心调控因子AphA、OpaR的可能存在相互调控作用。结论:研究结果表明,副溶血弧菌LysR型转录调节因子VPA0961在低盐条件下表达水平明显高于在高盐条件下的表达水平。VPA0961对细菌的动力有促进作用,对生物膜形成、溶血活性、细胞粘附活性有一定的正调节作用,而对小鼠致死毒性有负调节作用。相应的作用机制可能与促进鞭毛基因、T3SS1和T6SS2基因的转录,抑制VP-PAI基因的转录相关。VPA0961还可能与QS密度感应系核心调控因子AphA、OpaR有相互调节作用。