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髓系白血病是成人常见的白血病类型,包括急性髓系白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。AML是一个异质性疾病,原癌基因的突变、染色体异常发生率高。AML的治疗主要分为两个阶段,第一阶段为诱导治疗,常用阿糖胞苷联合蒽环类抗生素。第二阶段为缓解后治疗,采用联合化疗或造血干细胞移植。过去的三十年,65岁以下的年轻AML的生存率得到一定的改善,主要源于支持治疗的改善,使得患者能耐受联合化疗以及移植,从而获得长期生存,但是超过三分之一的患者会出现复发。老年白血病患者由于难以耐受化疗及移植,治疗效果欠佳,在过去的几十年中长期生存无明显改善,5年的总生存不到10%。难治复发及老年患者是AML的治疗难点,需要探讨新的治疗。分子靶向治疗由于其特异性,具有高效低毒的特点,成为近年来肿瘤治疗研究的热点。突变的FLT3抑制剂、ABT-199、IDH抑制剂等正在进行临床试验,初步显示其抗白血病的优势。虽然在AML靶向治疗方面,已经有了一些研究进展,但由于AML的患者具有较大的异质性,需要寻找更多的靶点,对AML患者进行个体化治疗。而对于CML的治疗,靶向药物伊马替尼及其二代、三代酪氨酸酶抑制剂(TKI)已经取得巨大的成功,但是仍然有20-51%的CML患者对TKI耐药。TKI耐药的原因众多,包括Abl酪氨酸激酶区域的点突变、BCR/ABL基因扩增或过表达、ATP药泵表达增高、SRC家族激酶活性异常增高、干细胞耐药、骨髓微环境介导耐药、表观遗传学介导的耐药等。TKI耐药是CML治疗的难题,探讨TKI以外的其他治疗有助于克服TKI耐药。表皮生长因子底物8(EPS8)是一个表达在细胞浆的接头蛋白。EPS8是EGFR等受体型和非受体型酪氨酸激酶的底物,其结构从N端到C端分别包括磷酸化酪氨酸结合蛋白域、SH3以及SAM-PNT域,可以与其他蛋白组成复合物,传递信号。研究表明 EPS8 可分别与 Abil、RN-tre、Shc、Shb、Dvl-1、IRSp53 等蛋白结合,组成复合物传递信号,参与细胞骨架的重塑、增殖、凋亡、粘附、迁移、受体内化等生理过程。近年来的研究发现EPS8还参与恶性肿瘤的发展、侵袭转移。多项研究表明EPS8在鳞癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤中高表达,并与侵袭、预后相关,被认为是一个原癌基因。然而,EPS8在血液肿瘤的研究较少,EPS8是否参与白血病的生物学过程尚不清楚。我们前期研究发现AML患者骨髓EPS8 mRNA较正常人骨髓表达增高,与对化疗的反应相关,但其参与白血病生物学过程的机制尚不清楚。本研究分三个部分探讨了 EPS8在髓系白血病生物学过程中的作用及其机制:Bcr-abl+细胞系及CML患者EPS8表达情况;过表达EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的影响;沉默EPS8对髓系白血病生物学功能的影响。结果发现在初发CML患者骨髓EPS8 mRNA表达高于正常对照,治疗后缓解的CML患者骨髓EPS8 mRNA水平低于初发CML患者。过表达EPS8使髓系白血病细胞增殖加快、凋亡减少、粘附迁移能力增加、对药物敏感性下降,PI3K/AKT、RAS/ERK、JAK2/STAT5信号通路激活,而沉默EPS8有相反的作用。本研究证实了 EPS8参与髓系白血病生物学过程,提示EPS8可作为髓系白血病治疗的靶点之一。第一章Bcr-abl+细胞系及CML患者EPS8表达情况目的探讨EPS8在Bcr-abl+细胞系及CML患者骨髓单个核细胞的表达方法:采用Q-RT-PCR方法对2013-2015年南方医科大学珠江医院血液科CML患者骨髓标本及广州金域医学检验中心CML RNA标本共98例及非白血病骨髓标本11例进行检测EPS8基因mRNA表达。98例CML患者中,慢性期58例,加速期11例,急变期21例,治疗后血液学缓解8例。EPS8与内参比值以2-ΔΔCt表示。采用western blot方法对CML细胞株KBM5、MEG01、K562、小鼠abl+温度敏感B淋巴细胞株S4C2-1、S9、小鼠32D-p210-野生型、32D-p210-T315I细胞株检测EPS8蛋白的表达。结果:1.CML不同分期EPS8与内参比值中位数分别为慢性期4.12(0.76-13.2),加速期 3.25(1.77-9.01),急变期 4.12(2.11-9.41),治疗后血液学缓解 1.46(0.39-1.79),正常对照 1.00(0.90-1.24)。采用非参数分析的多样本秩和检验进行统计学分析。慢性期、加速期、急变期、治疗后血液学缓解及正常对照的平均秩次分别为58.16、64.14、63.48、32.62、29.32,总体有统计学差异(P=0.006)。慢性期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异(P值分别为0.047及0.029),加速期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异(P值分别为0.010及0.001),急变期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异(P值分别为0.005及0.000)。2.对三株人CML细胞株KBM5、MEG01、K562分析EPS8蛋白表达,发现MEG01表达低,KMB5及K562表达高。发生恶性转化的稳定转染小鼠温度敏感Abl病毒的B淋巴细胞株S4C2-1的EPS8蛋白水平高于亲代未恶性转化细胞S9。转染了突变型BCR/ABL-T315I的TKI耐药小鼠髓系细胞株32D-p210-T315I 的 EPS8 表达高于野生型 32D-p210-wt。结论:初发CML患者骨髓EPS8 mRNA高于正常对照,治疗后骨髓缓解的CML患者EPS8表达水平下降。恶性转化细胞S4的EPS8蛋白水平高于亲代未转化细胞SP9,TKI耐药的32D-p210-T315I细胞EPS8蛋白水平高于32D-p210-wt,提示EPS8参与CML的生物学过程。第二章过表达Eps8对髓系白血病细胞生物功能的作用及其机制研究目的:探讨过表达Eps8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制。方法:构建pLVX-hEPS8-Puro及pLVX-AcGFP1-N1慢病毒载体,转染到293T细胞包装表达hEPS8及GFP的慢病毒,感染HL60细胞并用嘌呤霉素筛选,建立稳定转染EPS8的HL60细胞株HL60-EPS8及其对照细胞株HL60-GFP。采用CCK8检测HL60-EPS8细胞株及对照细胞、亲代细胞的增殖。用Annexin-APC/7-AAD染色后流式细胞仪检测细胞的凋亡。用PI对细胞染色后流式检测细胞周期。将细胞铺在包被了 fibronectin的培养板上,1.5小时后光学显微镜下观察粘附板底的细胞,并用CCK8检测粘附细胞的OD值。用Transwell小室检测细胞的迁移能力。用荧光标记的鬼笔环肽检测细胞的F-actin。将柔红霉素、阿糖胞苷在不同浓度、不同时间处理细胞,CCK8检测细胞的存活率。采用 western blot 检测细胞信号通路的蛋白 p-AKT、p-ERK、p-STAT5、p-PP2Ac。结果:1.成功构建过表达EPS8的HL60-EPS8细胞株,mRNA水平EPS8表达为对照细胞HL60-GFP细胞株的52.09倍,蛋白水平EPS8表达为对照细胞HL60-GFP细胞株的10.62倍。2.24 小时 HL-60 OD 值为 0.44±0,HL60-GFP 为 0.44±0.01,HL60-EPS8 为0.47±0,不同组间有差异(F=31.864,P=0.001)。HL60-EPS8 与 HL60 及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显著性意义。(P均<0.01)。第48 小时 HL-60 OD 值为 0.62±0.01,HL60-GFP 为 0.62±0.01,HL60-EPS8 为0.67±0.01。不同组间有差异(F=18.827,P=0.003),HL60-EPS8 与 HL60 及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显著性意义(P均<0.01)。72小时 HL-60 OD 值为 0.86±0.01,HL60-GFP 为 0.87±0.01,HL60-EPS8 为1.01±0.03。不同组间有差异(welch=28.388,P=0.008)。HL60-EPS8 与 HL60及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显著性意义(P均<0.05)。3.细胞在包被fibronetin的培养板上培养1.5小时,光学显微镜下观察到HL60-EPS8数量多于HL60-GFP及HL60。CCK8计数显示HL60细胞粘附在 96 孔板细胞 OD 值为 0.43±0.05,HL60-GFP 为 0.51±0.06,HL60-EPS8为0.69±0.07。三组细胞粘附在fiberonectin的细胞OD值有显著性差异(F=28.432,P=0.000)。HL60-EPS8 组粘附细胞 OD 值与 HL60、HL60-GFP组相比,差异均有显著性意义(P均<0.001)。4.采用 annexin V/7-AAD 双染法检测凋亡,HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 的早期凋亡细胞比例分别为3.31±0.21%、3.7±0.2%、2.43±0.06%。三组细胞的早期凋亡比例有显著性差异(F=43.712,P=0.000)。HL60-EPS8早期凋亡比例与HL60、HL60-GFP组相比,差异均有显著性意义(P均<0.01)。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 的晚期凋亡细胞比例分别为 1.13±0.09%、1.04±0.13%、1.01±0.07%,三组细胞的晚期凋亡比例无显著性差异(F=1.098,P=0.392)。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞的总凋亡比例分别为4.44±0.28%、4.74±0.26%、3.44±0.03%。三组细胞的总凋亡比例有显著性差异(Welch=44.730,P=0.008)。HL60-EPS8 总凋亡比例与 HL60、HL60-GFP相比,差异均有显著性(P<0.05)。5.PI染色测定细胞周期,发现HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞S比例分别为 48.39±0.87%、55.44±0.25%、60.57±0.87%。三组细胞 S 期比例之间差异有显著性(F=213.519,P=0.000)。三组细胞多重组间比较,发现三组细胞S期比例差异均有显著性(P均<0.05)。6.Transwell小室检测迁移能力,在光学显微镜下观察到HL60-EPS8细胞从上室迁移到下室细胞明显多于HL60、HL60-GFP细胞。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 下室细胞的 OD 值分别为 0.99±0.01,0.96±0.02,1.23±0.02,三组迁徙细胞OD值差异有显著性(F=544.573,P=0.000)。HL60-EPS8组迁移细胞OD值与HL60、HL60-GFP相比,差异均有显著性(P均<0.001)。7.用荧光标记的鬼笔环肽对F-actin染色,在共聚焦显微镜下观察HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞F-actin分布情况,三组细胞无明显差异。8.用不同浓度柔红霉素分别处理HL60-GFP、HL60-EPS8细胞24小时、48小时、72小时。24小时,在15nM、30 nM、60nM、120 nM浓度的柔红霉素作用下HL60-EPS8存活率均高于HL60-GFP组,差异有显著性(t-7.120,P=0.002;t=-6.664,P=0.003;t=-34.689,P=0.000,t=-19.724,P=0.000)。48小时,在15nM、30 nM、60nM、120 nM浓度的柔红霉素作用下HL60-EPS8存活率均高于HL60-GFP组,差异有显著性。(t=-25.216,P=0.000;t=-69.148,P=0.000;t=-158.408,P=0.000,t=-16.612,P=0.000)。72 小时,在 15nM、30nM、60nM浓度HL60-EPS8细胞存活率均高于HL60-GFP,在各浓度均有统计学意义(t=-50.289,P=0.000;t=-38.240,P=0.000;t=8.316,P=0.001)。用阿糖胞苷分别处理HL60-GFP、HL60-EPS8细胞株,比较不同浓度(0、250nM、500nM、1000nM),不同时间点(48小时及72小时)与不用药细胞相比的存活率。48小时在250nM、500nM、1000nM浓度细胞存活率进行分析,HL60-EPS8细胞存活率在各浓度均高于HL60-GFP,差异具有显著性(t=-8.268,P=0.000;t=-7.714,P=0.000,t=-7.408,P=0.000)。72 小时在 250nM、500nM、1000nM浓度细胞存活率进行分析,HL60-EPS8细胞存活率在各浓度均高于 HL60-GFP,差异具有显著性(t=-10.447,P=0.000;t=-11.632,P=0.000,t=-15.908,P=0.000)。9.信号通路蛋白分子检测提示HL60-EPS8细胞的p-ERK、p-AKT、p-STAT5高于HL60-GFP,而p-PP2Ac水平低于对照细胞。结论:过表达EPS8后HL60的增殖加快,凋亡减少,粘附能力增加,迁移能力增加,对化疗药物的敏感性下降,p-ERK、p-AKT、p-STAT5水平升高。EPS8可能通过调控RAS/ERK、PI3K/AKT、JAK2/STAT5信号通路调控细胞生物学功能。第三部分沉默EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制研究目的探讨沉默EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制研究方法构建4个shRNA-EPS8质粒载体,分别转染到293T细胞,包装沉默EPS8的慢病毒。将慢病毒感染K562,选择沉默EPS8效率最高的病毒继续用嘌呤霉素筛选,构建稳定沉默EPS8的K562细胞株K562-shRNA-EPS8及对照细胞株K562-GFP。采用MTT方法检测K562-shRNA-EPS8及对照细胞24小时、48小时及72小时增殖。采用Annexin V-APC/7-AAD染色,流式检测K562-shRNA-EPS8及对照细胞的凋亡。用PI对K562-shRNA-EPS8及对照细胞染色,流式检测细胞周期。提取K562-shRNA-EPS8及对照细胞总蛋白,采用western blot 方法检测 p-AKT、p-ERK、p-PP2Ac、p-STAT5、PTEN。结果1.设计4条沉默EPS8的序列,分别连接入慢病毒载体,进行PCR测序,测序结果提示连接在载体上的序列和目的序列一致。2.将慢病毒感染K562细胞,三天后在荧光显微镜下观察感染率在70%以上。细胞经扩增及嘌呤霉素筛选后,Q-RT-PCR检测抑制效率。4个慢病毒干扰EPS8 效率分别为 58.03%、14.6%、13.67%、74.93%,western blot 验证在蛋白水平序列4干扰EPS8最显著,选取序列4慢病毒感染的K562细胞为功能实验用的稳定转染株。3.MTT检测K562-shRNA-EPS8细胞在24小时、48小时、72小时的OD值。结果发现24小时K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞OD值分别为0.61±0.01、0.58±0.02、0.56±0.02,发现三组之间差异有显著性(F=5.328,P=0.030)。K562-shRNA-EPS8细胞与K562-GFP细胞相比,均值差异无显著性(P>0.05)。48 小时 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞 OD 值分别为 0.90±0.02、0.87±0.03、0.79±0.02。三组均数差异有显著性(F=23.073,P=0.000),发现K562-shRNA-EPS8细胞与K562-GFP细胞相比,均值差异有显著性(P<0.05)。72 小时 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞 OD值分别为1.19±0.08、1.13±0.07、0.99±0.11。三组均值差异具有显著性(F=5.377,P=0.029)。K562-shRNA-EPS8 细胞与 K562-GFP 细胞相比,OD值差异有显著性(P<0.05)。4.用 Annexin V-APC 及 7-AAD 对 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞进行染色后,流式检测细胞凋亡。结果发现K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞早期凋亡分别为 2.66±0.14%,6.25±0.10%,14.27±0.06%;三组早期凋亡率差异有显著性(F=9506,P=0.000)。K562-shRNA-EPS8组和K562、K562-GFP组相比,差异均有显著性(P均<0.001)。K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞晚期凋亡率为1.19±0.06%、2.18±0.17%、6.45±0.08%,三组之间晚期凋亡率差异有显著性(F=1859,P=0.000)。K562-shRNA-EPS8 组和 K562、K562-GFP 组相比,晚期凋亡率差异均有显著性(P均<0.001)。K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞总凋亡率为3.85±0.20%、8.43±0.11%、20.72±0.13%。三组之间总凋亡率差异有显著性(F=9912,P=0.000)。K562-shRNA-EPS8 组和 K562、K562-GFP组相比,总凋亡率差异均有显著性(P均<0.001)。5.用PI对K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8细胞进行染色,流式检测细胞周期显示K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8细胞的G1期细胞比例为47.78±0.48%、48.04±0.66%、54.85±0.45%,三组均值差异有显著性(F=163.847,P=0.000),K562-shRNA-EPS8 与 K562、K562-GFP 相比,差异均有显著性(P均<0.001)。6.将细胞加入包被fibronectin的96孔板,培养1.5小时,PBS洗2遍,光学显微镜下观察粘附板底的细胞,观察到粘附在fibronectin的K562-shRNA-EPS8细胞比K562、K562-GFP细胞数量减少。CCK8计数显示K562细胞粘附在96 孔板细胞OD值为 0.48±0.05,K562-GFP 为 0.46±0.29,K562-shRNA-EPS8为0.35±0.06。三组细胞粘附在fiberonectin的细胞OD值有显著性差异(F=12.060,P=0.001)。K562-shRNA-EPS8 组粘附细胞 OD 值与 K562、K562-GFP组相比,差异均有显著性意义(P均<0.01)。7.采用transwell小室法检测细胞的迁移能力,经过在显微镜下对K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8 组的下室细胞进行观察,发现K562-shRNA-EPS8下室细胞明显比其他两组对照细胞数量减少。CCK8法对下室细胞进行定量分析提示K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8下室细胞OD值分别为0.14±0.00,0.14±0.00,0.10±0.00。三组迁徙细胞OD值差异有显著性(F=208.245,P=0.000)。K562-shRNA-EPS8 组迁移细胞 OD 值与 K562、K562-GFP相比,差异均有显著性(P均<0.001)。8.用伊马替尼分别处理K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞株,结果发现48小时在1.2μM、1.6μM、2.0μM的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显著性(t=3.441,P=0.03;t=12.093,P=0.000;t=11.078,P=0.000)。72 小时在 0.8μM、1.2μM、1.6μM、2.0μM 的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显著性(t=17.079,P=0.000;t=5.204,P=0.029;t=34.692,P=0.000;t=23.603,P=0.000)。用柔红霉素分别处理K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞株,48 小时在 0.05μM、0.1μM、0.15μM的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显著性(t=17.802,P=0.000;t=15.563,P=0.000;t=5.665,P=0.001)。72 小时在0.025μM、0.05μM、0.075μM、0.1μM 的浓度,K562-shRNA-EPS8 细胞存活率低于 K562-GFP,差异均有显著性(t=6.736,P=0.001;t=7.857,P=0.000;t=8.617,P=0.000;t=4.638,P=0.004)。9.提取 K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8 细胞的蛋白,检测 p-ERK、p-AKT、p-STAT5、PTEN的表达变化,结果发现K562的EPS8沉默后导致p-ERK、p-AKT、p-STAT5 水平下降,而PTEN的水平升高。并且,BCR/ABL磷酸化水平下降,磷酸化PP2Ac水平升高。结论成功构建了干扰EPS8的K562-shRNA-EPS8稳定转染株及对照细胞株K562-GFP。K562-shRNA-EPS8细胞的增殖低于对照细胞,早期凋亡及晚期凋亡均较对照细胞增加,细胞周期阻滞在G1,p-ERK、p-AKT、p-STAT5水平下降,而PTEN的水平升高。沉默EPS8可能通过影响RAS/ERK、PI3K/AKT、JAK2/STAT5信号通路影响K562细胞的增殖、凋亡、细胞周期。EPS8有望成为克服CML耐药的靶点,为CML克服耐药的个体化治疗提供新思路。