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嫩度是决定牦牛肉品质和分级的主要因素,宰后成熟可以有效改善牦牛肉的食用品质尤其是嫩度。由于牦牛宰杀放血后,切断了肌肉组织与外界环境的主要沟通、供氧,牦牛肉肌细胞有可能发生细胞凋亡(Apoptosis),宰后成熟过程与细胞凋亡过程类似,所以将细胞凋亡理论应用到牦牛肉宰后成熟机制是当前研究的新领域,而细胞凋亡发生在牦牛肉宰后的哪一个阶段,细胞凋亡的发生对宰后牦牛肉品质及微观结构有怎样重要的影响,目前还是未知数。本文以10头青海大通牦牛作为研究对象,选取前躯肱三头肌(TB)、中躯背最长肌(ML)、后躯半膜肌(SM)作为实验样品,研究宰后牦牛肉细胞内环境因素变化是否有利于细胞凋亡的发生,观察成熟过程中是否发生了细胞凋亡,并对宰后不同阶段的细胞凋亡程度进行量化和验证,探索凋亡效应酶-3(Caspase-3)的活化途径,确定Caspase-3对肌原纤维蛋白的水解作用,通过相关性分析阐明细胞凋亡的发生对牦牛肉品质及微观结构的作用,从而进一步完善牦牛肉宰后成熟机制,为提高牦牛肉品质、充分利用牦牛肉资源提供理论基础。本研究包括六部分内容,得到的主要结论如下:1宰后牦牛肉成熟过程中细胞内环境因素的变化不同部位牦牛肉中的Na+-K+-ATPase活力在宰后24h后显著下降(p<0.01),TB的Na+-K+-ATPase活力在宰后48h显著下降(p<0.01),ML和SM的肌细胞中Ca2+-ATPase活力在宰后前12h达到最大值,TB的Ca2+-ATPase活力在宰后24h达到最大值;宰后24h TB和SM的ATP含量逐渐趋于平稳,宰后48h ML的ATP含量逐渐趋于平稳;宰后不同部位牦牛肉中pH值均呈现先下降后升高的趋势;TB、ML、SM的pH值均在宰后48h下降到最小值,说明宰后牦牛肉细胞内环境因素有利于细胞凋亡的发生。2宰后牦牛肉成熟过程中细胞凋亡的形态学特征及细胞凋亡率研究宰后168h,线粒体几乎全部开始皱缩变成高电子密度的小黑点,并且逐渐聚集在一起,随着牦牛肉宰后成熟时间的延长,细胞间隙逐渐增大。细胞核核质边缘化,形成凋亡小体,同时细胞核皱缩的增加,说明宰后牦牛肉成熟过程中发生了细胞凋亡;宰后2h到宰后72h凋亡细胞核的数量呈缓慢的线性增多,宰后72h以后迅速增多,宰后168h,TB和ML中阳性细胞核数量差异极显著(p<0.01),说明宰后牦牛肉成熟过程中确实发生了细胞凋亡。3宰后牦牛肉成熟过程中细胞凋亡因子及Caspase-3、8、9蛋白表达变化研究宰后牦牛肉中Caspase-3在17kDa处出现降解片段,Caspase-3活力发生显著变化,说明Caspase-3参与了牦牛肉成熟嫩化过程;Caspase-9在23kDa处出现降解片段,Caspase-9活力与Caspase-3活力极显著相关(p<0.001),说明Caspase-9介导的内源性途径参与了Caspase-3的活化;Caspase-8劈开为18kDa活化片段,相关性分析中Caspases-8与Caspase-3呈显著相关性(p<0.05),说明牦牛肉在宰后初期缺氧的情况下活化了Caspase-8,并且Caspase-8介导的外源性途径也参与了Caspase-3的活化。4宰后牦牛肉成熟过程中Caspase-3对肌原纤维蛋白的水解作用通过Caspase-3专一性抑制剂(DEVD)对不同部位牦牛肉进行处理,借助SDS-PAGE全蛋白电泳和免疫印迹技术检测发现,宰后前48h,TB和SM中DEVD组没有出现肌钙蛋白-T 30kDa和肌间线蛋白的降解产物,宰后48h,TB和SM中DEVD组出现肌钙蛋白-T 30kDa和肌间线蛋白的降解产物,而ML中DEVD组的肌钙蛋白-T的30kDa特征降解产物及肌间线蛋白的降解早于TB和SM中出现,说明Caspase-3在宰后前48h参与了肌原纤维蛋白的水解,结合之前的研究结果,进一步说明宰后初期细胞凋亡的发生,启动Caspases级联反应,激活Caspase-3水解肌纤维蛋白,参与牦牛肉成熟嫩化。5宰后牦牛肉成熟过程中细胞凋亡的发生对其品质的影响加压损失和蒸煮损失与细胞凋亡率均呈显著相关性(p<0.05),Caspase-3活力与加压损失呈显著相关性(p<0.01),细胞凋亡率与L*、a*、b*均呈显著相关性(p<0.05),Caspase-3活力与L*、a*、b*均呈显著相关性(p<0.01);MFI与细胞凋亡率呈显著相关性(p<0.05),MFI与Caspase-3活力呈显著相关性(p<0.01),剪切力值与细胞凋亡率呈极显著相关性(p<0.001),硬度、粘着性和咀嚼性与细胞凋亡率均呈显著相关性(p<0.05),Caspase-3活力只与弹性呈显著相关性(p<0.05)。以上结果说明,牦牛肉宰后成熟过程中细胞凋亡的发生,及其程度的加深与牦牛肉品质变化是同步进行的。6宰后牦牛肉成熟过程中细胞凋亡的发生对其肌纤维超微结构的影响细胞凋亡率与肌纤维直径、肌节长度和细胞间隙均呈极显著相关性(p<0.001),Caspase-3活力与肌纤维直径和肌节长度均呈显著相关性(p<0.01),ML和SM中Caspase-3活力与细胞间隙无显著相关性。以上结果说明,细胞凋亡的发生,诱导激活Caspase-3,破坏肌纤维结构的完整性,改善了牦牛肉嫩度。综上所述,宰后牦牛肉成熟过程中发生了细胞凋亡,并且随着凋亡程度的不断加深,线粒体膜通透性改变,细胞间隙面积增大,启动Caspases级联反应,激活Caspase-3,水解肌纤维蛋白,导致肌原纤维结构完整性丧失,提高了牦牛肉的嫩度,并对肉色、保水性及质构参数造成了一定的影响。