GhDGK基因家族生物信息学分析及GhDGK7b的抗逆功能研究

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二酰基甘油激酶(DGK)可以磷酸化二酰基甘油(DAG)进而生成磷脂酸(PA),DAG与PA都是信号分子,DGK可能在涉及调控DAG与PA的信号传导中发挥重要作用。为研究DGK基因在植物体内作用,有必要对棉花DGK基因家族成员进行研究。本论文克隆了陆地棉DGK基因的相关家族成员,对基因结构、表达和进化进行分析,并对GhDGK7b的生物学功能进行了初步研究。利用棉花基因组测序资料,建立陆地棉(Gossypium hirsutum L.)基因组本地数据库,以拟南芥DGK的序列为“种子”进行电子克隆。依据电子克隆结果设计引物,使用陆地棉“中9807”cDNA作为模板进行PCR扩增,测序后确定基因的碱基序列,获得DGK基因序列后进行相关基因结构、表达特性及进化分析。结果表明,陆地棉DGK基因家族(GhDGKs)由15个基因组成,GhDGKs于染色体上的分布不完全对称,D13染色体上含有2个GhDGK,其余染色体上含有1个GhDGK。所有GhDGKs都含有二酰基甘油激酶催化域,催化域包含一个假定的ATP连接位点,序列为GXGXXG(G代表甘氨酸,X代表任何其他氨基酸)。DGKs 可以分为 I(DGK1)、II(DGK3、DGK4)、III(DGK5)3个亚家族。7对 GhDGK基因(GhDGK1c 和 GhDGK1d、GhDGK1e 和 GhDGK1f、GhDGK4a和 GhDGK7a、GhDGK4b和 GhDGK4c、GhDGK7b和GhDGK7c、GhDGK5a 和GhDGK5b、GhDGK5j和GhDGK5e)Ka/Ks结果的比值小于1,表明它们经历了纯化选择。GhDGKs在棉花不同组织中表达存在差异,主要在叶片和根组织中表达,叶片组织中总体表达水平较高。在旱、盐、冷等非生物胁迫和ABA处理下GhDGKs也表现出不同水平的表达,存在差异。不同基因有不同类型和数量的顺式元件,如MBS(干旱)、LTR(低温)等胁迫相关顺式作用元件,表明不同的GhDGKs具有不同逆境胁迫响应机制。盐或甘露醇胁迫下,过表达GhDGK7b的拟南芥较野生型对照和dgk7突变体系(salk059060)有更高的萌发率。150mmol/L盐处理下,过表达GhDGK7b株系OE1、OE2萌发率分别比WT提高37.60%和28.19%。在300mmol/L甘露醇处理下,OE2萌发率比WT提高4.24%。盐或甘露醇处理下,过表达GhDGK7b基因拟南芥较野生型对照与dgk7有更长的主根长度。150 mmol/L盐处理后,过表达GhDGK7b株系OE1、OE2主根长度显著高于野生型对照和dgk7,分别比WT提高17.27%和28.30%,在300 mmol/L甘露醇处理下,OE1、OE2的主根长度分别比WT提高56.09%和51.18%。在干旱胁迫至14d,过表达GhDGK7b的拟南芥株系OE1、OE2较野生型的相对水含量分别提高106.26%和162.80%。复水3d后发现,OE2植株叶片转绿恢复生长,OE1植株部分恢复生长,而野生型和dgk7突变体植物则无法恢复生长状态。干旱或盐处理14d,过表达GhDGK7b拟南芥与野生型对照和dgk7相比具有更低的离子渗漏、MDA及H2O2含量;过表达GhDGK7b植株叶片具有更高CAT、SOD、POD等抗氧化酶活性。过表达GhDGK7b拟南芥在干旱或盐处理胁迫下细胞受到的膜损伤程度更低且维持了更好的抗氧化能力。因此,过表达GhDGK7b能够提高拟南芥对于盐和干旱胁迫下的耐性。综上所述,通过对陆地棉中9807的DGKs基因家族的初步分析和GhDGK7b的初步功能研究,发现GhDGKs基因家族可能参与了一些植物非生物胁迫应答过程。过表达GhDGK7b基因拟南芥的耐盐、耐旱性能力提高,表明GhDGK7b基因可作为棉花耐盐耐旱基因工程的候选基因。此外,本论文还对实验室获得过表达ZmPIS基因棉花株系MP1、MP2和MP3的耐旱性进行了评价。在大田自然干旱条件下,过表达ZmPIS基因棉花的叶片较野生型对照具有更高的碳同化能力和更好的PSⅡ性能,并且籽棉产量也显著提高。盆栽干旱处理下过表达棉花叶片的ABA水平较野生型对照显著提高,且ABA合成的相关基因GhNCED、GhABA2、GhAAO3的表达水平更高、ABA降解相关基因GhCYP707A的表达水平更低,推测ZmPIS可通过提高棉花叶片中ABA含量来调控过表达植株对干旱胁迫的应答。
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