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小檗碱是一种历史悠久、作用广泛的的异喹啉类生物碱。近年来,多项工作报道它在临床上对2型糖尿病患者有降血糖作用,但其分子机制尚不明晰。
我们首先发现,在L6肌细胞上,小檗碱促进葡萄糖吸收,其作用通过激活激酶AMPK,不依赖于胰岛素信号通路。韩国及澳大利亚研究人员发现AMPK是小檗碱在动物水平降糖降脂的关键靶点。然而,小檗碱生物利用度很低,有效剂量很高；小檗碱对AMPK激活作用的直接靶蛋白仍不明晰。于是,我们围绕小檗碱药效的改进和药理机制的研究,进一步开展了工作。
我们以AMPK激活和葡萄糖摄取为指标,对小檗碱进行了结构改造,发现二氢小檗碱及其衍生物基本保持了小檗碱活性。二氢小檗碱生物利用度达2.65％,明显高于小檗碱,且口服后大量转化为小檗碱。在肥胖和糖尿病小鼠模型上其有效剂量降低至100mg/kg/day。此外,我们发现二氢小檗碱在动物水平产生整体降糖效果的重要途径是促进外周组织的葡萄糖摄取。
我们发现,小檗碱对AMPK的激活作用,需要上游激酶LKB1或CaMKKβ的参与,但不专一依赖于任何一个上游激酶。并发现二氢小檗碱和小檗碱均通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ使AMPK激活,其作用机制类似于二甲双胍和罗格列酮。
为改善二氢小檗碱的水溶性和酸稳定性,我们将其进一步改造为化合物Di-Me。Di-Me保持了BBR通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ激活AMPK和促进葡萄糖摄取的功能,其生物利用度进一步提高至10.02％。在高脂饲料诱导的肥胖小鼠上,15mg/kg/day的Di-Me明显降低血糖、血脂、降低肝脏和皮下脂肪占体重比例,并增强胰岛素敏感性。50mg/kg/dav的Di-Me明显降低db/db小鼠的随机血糖和空腹血糖、血浆甘油三酯,提高胰岛素敏感性,其效果显著优于同剂量的二氢小檗碱。
为明确小檗碱作用的直接靶蛋白,我们设计合成了小檗碱的基于活性的探针分子Probe4,它很好的保持了小檗碱在细胞水平激活AMPK和促进葡萄糖吸收的活性。我们利用Probe4在L6肌细胞等多个细胞中标记到60kd蛋白,该蛋白可被小檗碱特异性竞争。肽指纹图谱鉴定证明该蛋白为ProteinX,并在免疫沉淀和免疫印迹实验中得以验证。目前研究认为ProteinX的功能与糖酵解途径相关。
我们发现小檗碱在分子水平抑制ProteinX的活性,是ProteinX的混合型抑制剂。在细胞水平,小檗碱对ProteinX有更强的抑制活性,其探针分子结合于ProteinX的活性位点。利用RNA干扰及腺病毒介导的过表达和无活性突变方法,我们发现ProteinX的活性升降不影响L6肌细胞中AMPK磷酸化水平及葡萄糖摄取。为进一步探索小檗碱影响AMPK激活和线粒体complexⅠ活性的直接作用蛋白,我们对大鼠线粒体进行了进一步的标记,并鉴定到线粒体蛋白ProteinY和ProteinZ,其影响complexⅠ活性的深入机制研究正在进行中。
有趣的是,ProteinX活性的降低明显抑制了葡萄糖最终氧化分解的过程。在用AMPK特异性抑制剂compoundC剥离AMPK激活造成的葡萄糖摄取增加后,小檗碱明显抑制L6肌细胞的葡萄糖氧化分解。在无线粒体的大鼠红细胞中,小檗碱抑制糖酵解,降低糖酵解终产物ATP和丙酬酸的含量,提高红细胞糖酵解支路中2,3-二磷酸甘油酸含量。在急性静脉注射中,小檗碱对大鼠体内红细胞代谢有类似影响。我们的工作揭示了小檗碱急性静脉注射毒性的新机制,提示ProteinX可能是小檗碱体内毒性靶点。
通过以上工作,我们证明了AMPK信号通路是小檗碱细胞和动物水平发挥降糖降脂效应的关键通路,指出对线粒体complexⅠ的抑制引发的AMP:ATP比率上升是小檗碱激活AMPK信号通路的主要途径,且这种激活作用不专一依赖于AMPK的某一个上游激酶。我们发现了二氢小檗碱在动物水平具有更高的生物利用度与较低的有效剂量,且发现了其更稳定、易吸收且药效更佳的衍生物Di-Me。我们发现了小檗碱的三个直接作用靶蛋白,其中ProteinX有可能是小檗碱静脉注射毒性作用的靶点之一。