论文部分内容阅读
背景临床上对心血管恶性事件的救治主要依赖于药物控制和手术干预,但是从治疗效果和长远收益来看,心肌梗死的死亡率只是得到了暂时的控制,而心力衰竭的死亡风险却在无形加剧。以干细胞替代治疗为主的实验研究,近年来已广泛开展,但仍受细胞来源、移植风险等客观因素的影响,同时又受伦理道德等因素的约束,在临床上尚未大规模应用。众所周知,成熟心肌细胞增殖能力很低,一旦受到损伤,导致大量心肌细胞坏死,心脏功能受损甚至衰竭,若能诱导成熟的心肌细胞进行分裂增殖,心脏再生的难题就有望得到彻底攻克。然而有关心肌细胞增殖再生方面尚有诸多问题。CyclinA2基因作为细胞周期的一个主控因子控制着细胞周期各个时相的及时转换和循环往复,对细胞周期正确发挥其调控作用至关重要,对于解决心肌再生问题具有很高的研究价值。目的探讨体外转染细胞周期素A2 (Cyclin A2)基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响,为心脏再生提供细胞学依据。方法1.心肌细胞原代培养采用酶联合消化法结合差速贴壁法,分离、培养、纯化大鼠乳鼠原代心肌细胞,在活细胞工作站下实时动态监测细胞的生长状态,摄片记录原代培养过程中心肌细胞的形态变化。2.基因转染心肌细胞原代培养第3天,分别转染带有预先包装好的携带目的基因Cyclin A2的重组腺病毒和仅含有绿色荧光蛋白的空病毒。3.实验分组(1)重组腺病毒CyclinA2基因转染组：转染带有强化绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)和Cyclin A2基因的重组腺病毒(Ad-CyclinA2-GFP); (2)空病毒转染组：转染不含目的基因仅有GFP的重组腺病毒(Ad-Null-GFP); (3)阴性对照组：未做转染处理,仅加入等量的培养基。4.GFP示踪技术和统计学分析评估原代大鼠心肌细胞的基因转染效率；对比实验组(重组腺病毒Cyclin A2基因转染组)和空病毒载体转染组的转染效率有无差异5.间接法免疫荧光双重标记转染后的细胞继续体外培养3-5 d,利用免疫荧光技术分别检测Cyclin A2、磷酸化组蛋白H3 (Phosphorylates Histone H3, H3P)、心肌肌钙蛋白-T (Cardiac Troponin T, cTnT)的表达情况。结果1.原代培养的心肌细胞8-12 h后多贴壁生长,并可见单个搏动的心肌细胞,频率约13-44次/分。3-5 d后细胞汇集成片状,形成细胞簇或单层细胞,搏动趋近同步性,收缩明显有力,频率约46-182次/分。2.荧光GFP示踪表明：重组腺病毒Cyclin A2转染组对心肌细胞的转染效率略低于空病毒转染组,空病毒载体侵染原代大鼠心肌细胞的效率几乎达到100%,重组腺病毒Cyclin A2侵染心肌细胞效率约为(97±0.74)%,活细胞工作站下可见转染成功的心肌细胞显示绿色荧光,并呈现簇状搏动。3.免疫荧光标记结果显示心肌细胞特异性标记蛋白cTnT分布于细胞质,细胞核中不存在表达；大鼠原代心肌细胞纯度高达(95±0.62)%；心肌细胞CyclinA2主要在胞核内聚集,少数分布于细胞质；H3P是一种有丝分裂期的特殊标记蛋白,以细胞核内分布为主。4.转染Cyclin A2基因后,心肌细胞有丝分裂指数明显增高,约为空病毒转染组和阴性对照组的3倍,且差异具有统计学意义(P<0.05); Cyclin A2基因转染组可见大量多核细胞,以双核为主,伴少量三核心肌细胞。结论1.本研究所采用的酶联合消化法结合差速贴壁法,所获得的原代心肌细胞不仅纯度高,而且细胞活力好。2.腺病毒对心肌细胞有很好的侵染效率,同时其毒性对细胞的影响不明显,因此可作为心肌细胞理想的转染载体。3.有丝分裂指数(H3P阳性率)是反映细胞增殖情况的有力证据,心肌细胞仍可进行有丝分裂,并非终末分化细胞。4. Cyclin A2基因过表达时可促进心肌细胞的增殖,有丝分裂指数增加,多数细胞形成双核。