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目的:肌成纤维细胞是促进创面愈合的肉芽组织的主要细胞成分,它由成纤维细胞分化而来.成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中表达的一种具有收缩性的特征性产物——α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)是参与伤口修复和愈合的重要物质,所以肌成纤维细胞在创面愈合过程中具有更重要的作用.但是关于糖尿病足创面肉芽组织中肌成纤维细胞的形成情况如何,目前未见相关研究.本文对糖尿病足创面肉芽组织和非糖尿病创面肉芽组织在基因和蛋白水平分析肌成纤维细胞相关特异性蛋白α-SMA的表达情况,并通过分离两组成纤维细胞进行α-SMA染色,在组织和细胞水平观察肌成纤维细胞在糖尿病足创面肉芽组织中的生成情况,探讨糖尿病足迁延不愈的机制. 方法: 1 经过纳入标准和排除标准的筛选,选取2016年1月到2017年6月于解放军白求恩国际和平医院接受住院治疗的糖尿病足患者10例作为实验组,并选取相同时间段内符合入排标准于本院烧伤科住院接受治疗的非糖尿病患者10例作为对照组. 2 两组受试者于入院后给予常规换药处理,并清除坏死组织,隔日一次,时间为10-15天,之后取创面局部新鲜肉芽组织.将肉芽组织分为3份,1份于4%多聚甲醛固定液固定后,行石蜡包埋,用于免疫组化染色.第2份取材后放入液氮使其迅速降温,然后转移至-80℃冰箱低温保存,进行Western blot和Real-time PCR检测.第3份进行肌成纤维细胞原代培养,然后进行免疫组化染色. 3 免疫组化处理:对两组肉芽组织中α-SMA的表达情况进行半定量分析.于光镜下(400×)观察呈棕黄色颗粒代表α-SMA染色阳性.在每份染色切片随机选取 10 个阳性区域,拍照并用数字医学分析系统(MoticMedical 6.0)进行α-SMA的光密度值检测,用平均光密度值(optical density，OD)对α-SMA的表达情况进行半定量分析. 4 Western blot:分析α-SMA在蛋白水平的表达.用Image J软件分析两组α-SMA的条带灰度值,每个条带中α-SMA的表达量以α-SMA与GAPDH条带灰度的比值来表示,对α-SMA进行蛋白定量分析. 5 Real-time PCR:检测α-SMA在基因水平的表达情况,即α-SMA mRNA的表达量,对α-SMA进行基因定量分析. 6 细胞培养:将标本放入生理盐水中短暂保存,然后取出,用剪刀剪碎组织块,用I型胶原酶消化,得到的细胞用"差时贴壁法"分离纯化得到成纤维细胞,然后进行原代培养,在培养到第3-4天,显微镜下观察,80%以上成纤维细胞伸展开,行细胞固定. 7 细胞免疫组化染色:对固定的细胞行α-SMA染色,染色阳性的即为肌成纤维细胞.观察并计算视野中染色阳性的细胞百分比. 结果: 1. 镜下观察免疫组化染色切片:两组均可见α-SMA表达的棕黄色颗粒,但和对照组相比,实验组的阳性染色的棕黄色颗粒稀疏,用平均光密度值半定量α-SMA的表达,对α-SMA进行分析,结果示:实验组α-SMA的表达量显著低于对照组(P<0.01). 2. 两组肉芽组织Western blot结果显示:分别统计实验组和对照组的α-SMA与GAPDH条带灰度的比值,对α-SMA的表达进行定量分析.实验组中α-SMA相对蛋白表达值为0.32±0.09,对照组肉芽组织中α-SMA的相对蛋白表达值为0.58±0.15,实验组的α-SMA表达量显著低于对照组(P<0.01). 3. Real-time PCR分析结果:实验组肉芽组织中α-SMA相对基因表达值是0.83±0.27,对照组中α-SMA的相对基因表达值为1.29±0.30,糖尿病足组肉芽组织的α-SMA mRNA表达低于对照组(P<0.01). 4. 对成纤维细胞固定后免疫组化染色:高倍视野(400×)观察,糖尿病足组的α-SMA染色阳性的呈棕黄色的肌成纤维细胞的染色比率明显少于对照组. 结论: 和非糖尿病足创面肉芽组织相比,糖尿病足创面肉芽组织中肌成纤维细胞的生成明显减少.由于肌成纤维细胞的减少能够引起创面局部收缩障碍,推测肌成纤维细胞生成减少可能是糖尿病足愈合困难、迁延不愈的原因之一.