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中药注射剂的不良反应是中医药发展过程中的一个巨大障碍。目前,关于中药注射剂的研究很多,其中关于有效成分毒理学及药理学方面的研究主要集中于绿原酸(Chlorogenic acid, CGA)上,主要研究的方向是CGA的致敏性。然而,中药注射剂不良反应的特征具有多样性,并且临床上观察到大量病例中出现了脏器的损伤。因此本实验从考察CGA以及同等含量的注射剂对机体脏器的损伤以及导致全身炎症反应(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS)的角度入手。以一个新的角度探讨CGA及相应注射剂的毒理作用。本篇论文由文献综述和实验研究两方面组成。文献综述分为两部分,第一部分首先分析了中药注射剂不良反应在临床上主要特点,之后重点论述CGA这一热点研究对象的药理毒理作用,以及CGA作为中药注射剂不良反应因素的研究成果和特点。第二部分根据中药注射剂不良反应的症状对全身性炎症反应及多脏衰的研究进展进行综述,为本实验设计提供思路和创新点。实验部包括CGA及其中药注射剂对引起大鼠多脏器衰竭的炎症瀑布学说中的细胞因子失衡的研究,并观察CGA对肺组织的损伤情况。实验主要分为三部分内容：第一部分探讨CGA及注射剂对大鼠血液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-a)以及IL-10(Interleukin-10, IL-10)表达的影响。选用健康雄性WIstar大鼠,利用腹腔注射的方法模拟中药注射液不良反应动物模型。分为生理盐水、CGA低剂量组(1.68mg/kg),清开灵注射液组、CGA高剂量组(7mg/kg)、双黄连注射液组(清开灵注射液中绿原酸含量与绿原酸一组相同,双黄连注射液中绿原酸与绿原酸二组相同)。选择7天和14天两个时间点,检测大鼠血清中IL-10和TNF-α的含量,观察CGA及注射剂对这两种因子表达的影响,并通过比较IL-10/TNF-α的值来分析大鼠炎症—抗炎反映的平衡情况。第二部分探讨CGA对大鼠的各器官中核转录因子：NF-kB的影响。选用健康雄性WIstar大鼠,经左侧颈静脉插管给药。分别以生理盐水和高剂量CGA干预(静脉滴注给药,2ml/h,给药1h)。给药2小时后,取大鼠脑、心、肺、结肠和肾组织进行检测。研究CGA对各重要器官中目前比较公认的炎症反应启动因子：核转移因子NF-kB表达的影响,通过分析比较,发现表达最先增多的器官,并做进一步研究。第三部分探讨CGA及注射剂对大鼠肺组织损伤的情况,选用健康雄性WIstar大鼠,通过腹腔注射的方法制作中药注射液不良反应动物模型。分组同实验一。选择7天和14天两个时间点,检测大鼠肺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的活性、血清中过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性、肺组织的含水量以及肺组织HE染色来评价肺的损伤情况。实验研究结果一、CGA及注射剂引起的大鼠血清TNF-α与IL-10的变化1、CGA及注射剂引起的大鼠血清TNF-α的变化本实验发现,连续注射低剂量CGA14天,可以开观察到TNF-α的升高。而同等CGA剂量的清开灵注射液,在7天时降低了血清中TNF-α的含量,14天时提高了血清中TNF-α的含量。出现这种现象的原因可能是由于：清开灵注射液有较强的抗炎作用,众多临床和实验文献报道其在炎症初期能够显著降低血清中TNF-α,清开灵注射剂是由50多种物质组成,可能其成分的复杂性导致了这一现象。高剂量的CGA和含有相同剂量CGA的双黄连注射液也使实验大鼠在7天时出现了血清中TNF-α降低,14天时出现了血清中TNF-α升高的变化。而且高剂量CGA、清开灵注射液、双黄连注射液三组间两两比较无差异。说明在改变血清中TNF-α浓度上,高剂量CGA、清开灵注射液、双黄连注射液三者有类似的药理作用。另外14天组中各组升高TNF-α的效果无差异,说明长时间注射CGA能引起大鼠炎症瀑布反应的作用与此次实验设计的两个CGA浓度无关。2、CGA及注射剂引起的大鼠血清IL-10的变化本实验发现,在连续7天给药后,相对于生理盐水组,低剂量CGA对血清中IL-10浓度影响不大,而含有同等剂量的清开灵对IL-10有抑制作用。在连续14天给药后,低剂量CGA提高了血清IL-10的浓度,而清开灵注射液对IL-10的作用不明显。出现这种现象的原因可能是：清开灵注射剂中CGA与注射剂中他的组分相互作用,出现了CGA药理作用的缩小。在连续7天给药后,相对于生理盐水组,高剂量CGA对血清中IL-10影响不明显,而含有同等剂量CGA的双黄连注射液表现出对血清中IL-10的抑制作用。在连续14天给药后,CGA高剂量组表现出对IL-10的抑制作用。而双黄连注射液能够提高IL-10浓度。两者比较发现在7天和14天两个时间点表现出的结果均有差异。出现这种现象的原因可能是：CGA与双黄连注射液中的其他成分出现相互作用,导致其药理作用与整体注射剂表现出不同效果。CGA低剂量和高级两相比较,两者在7天时无差异,在14天时表现出相反的作用,说明CGA长时间使用对血清中IL-10的改变存在剂量关系,低剂量激活IL-10,高剂量抑制IL-10。3、CGA及注射剂引起的大鼠血清IL-10/TNF-α比值的变化本实验发现,相对于生理盐水组,低剂量CGA对血清中IL-10/TNF-α的比值没有太大影响,而含有同等剂量CGA的清开灵注射液表现出了7天升高,14天降低的现象,两者出现不一致的原因可能是由于注射液中复杂的成分造成的。但是两者相对生理盐水组改变的趋势相同,因此CGA可能是清开灵注射液注射液对IL-10/TNF-α作用的一个重要因素。高剂量CGA对血清中IL-10/TNF-α的比值与含有同等剂量CGA的双黄连注射液表现出了7天升高,14天降低的现象,因此CGA可能是双黄连注射液注射液对血清中IL-10/TNF-α作用的一个主要因素。除CGA低剂量组外,其他三组均对IL-10/TNF-α的比值造成影响。其中7天时,比值升高,说明三者上调抗炎反应；14天时比值下降,说明三者上调炎症反应。这说明清开灵、双黄连、高剂量CGA均打破机体炎症—抗炎平衡,提示可能会发生MODS。二、CGA对大鼠各器官组织中核转移因子NF-k B表达的影响本实验发现经静脉注射高剂量CGA后2小时,大鼠肺组织中NF-k B的表达较生理盐水对照组有显著的增加,其他组织器官NF-k B的表达未出现明显变化。我们初步判断过量绿原酸引起的炎症瀑布反应及组织损伤可能首先累及肺组织。三、观察CGA及注射剂对大鼠肺组织的损伤情况1、CGA及注射剂对肺组织中髓过氧化物酶(MPO)活性的影响本实验发现注射CGA及含有CGA的注射液后,七天组的实验动物肺组织MPO活性与生理盐水组没有统计学差异。14天组的动物中,CGA高剂量组及双黄连组观测到MPO活性的明显提高,而CGA低剂量组和清开灵组与生理盐水组没有差异。说明高剂量的CGA和双黄连注射液长期使用能够促使大鼠肺组织中性粒细胞浸润,释放MPO可能进一步产生各种氧化剂和氧自由基对肺部造成损伤。2、CGA及注射剂对大鼠血清中过氧化氢酶(CAT)浓度的影响在连续给药七7天后,相对于生理盐水组,高剂量CGA能够提高大鼠血清中CAT,而CGA低剂量组、双黄连组和清开灵组并未发现明显差异。说明高剂量CGA在连续注射一周后大鼠体内CAT增加,说明大鼠处于抗氧化化反应的代偿期,代偿产生CAT以中和过氧化损伤物。连续给药14天后,相对于生理盐水组,低剂量CGA、高剂量CGA以及双黄连组均发现CAT活性降低,而清开灵组并未表现出明显差异。说明CGA和双黄连注射液能够引起机体的机体抗氧化能力失代偿的作用,使机体无力抵抗过多产生的过氧化损伤物。这可能是肺组织发生氧化损伤的另一个原因。清开灵的成分的复杂性造成了其对血清中CAT影响较为温和。以上数据说明,在注射CGA以及双黄连以后大鼠的抗氧化能力出现了代偿和失代偿的病理过程。3、CGA及注射剂对大鼠肺组织含水量的影响通过观察肺组织干湿重,发现连续7天给药并未对实验动物肺组织含水量产生显著影响。连续14天给药后,CGA低剂量组、高剂量组和双黄连组肺组织含水量明显高于生理盐水对照组,有统计学差异。清开灵组相对于生理盐水组无统计学差异但有升高的趋势。4、肺组织HE在连续给药14天后,绿原酸低剂量组可观察到肺间质充血,高剂量组和双黄连组可观察到,肺间质充血、水肿、肺泡间隙变小,炎性细胞浸润,双黄连组尤其明显。清开灵组并未观察到明显的病理变化,可能是由于其复方成分对CGA的减毒作用造成的。结论：1、高剂量的CGA、清开灵注射液、双黄连注射液能够使机体的TNF-α产生先下降后上升的的现象。低剂量的CGA在14天时也能提高TNF-α。因为TNF-α是对机体器官造成损伤的重要因子,所以其对组织器官管的损伤主要集中在14天左右,对肺组织损伤的研究也证实了这一点。2、四个组对IL-10作用表现出了明显不同,其中CGA和注射剂的不同可能是由于三方面原因造成：一、注射剂的成分复杂性导致。二、IL-10可能不直接由药物影响是一种机体平衡炎症反应的一种代偿因子,其产生的时间点和维持浓度的时间长短与机体内环境有关。3、通过观察IL-10/TNF-α发现,除CGA低剂量以外,其他三组均造成机体炎症—抗炎反应失衡,为进一步发生MODS打下基础。有文献报道当IL-10/TNF-α出现高比值时患者死亡率增高。本实验观察期间(14天),只观察到大鼠不良反应初期,炎症因子变化的紊乱及部分组织的过氧化损伤情况,未观察到大鼠的多脏衰产生及死亡现象,可能与用药剂量、给药途径和观察时间有关。为求进一步研究CGA及其注射剂引起的休克反应及多器官功能障碍综合征,还需进一步对给药剂量、给药途径和观察时间等因素进行研究。4、初步探索表明绿原酸直接或间接地通过增加核转移因子NF-k B表达启动炎症瀑布反应及组织损伤,并首先累及肺组织。进一步的研究应更加细化时间点和研究指标。5、CGA、双黄连注射液对肺组织的损伤可能是通过激活中性粒细胞,产生过多的H202,发生过氧化损伤反应,并抑制CAT活性造成的。清开灵对肺组织的损伤较小说明清开灵的其他成分对CGA有减毒作用。