【摘 要】
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漆酶(ρ-diphenol oxidase EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶.漆酶具有很多重要的生物学作用:在高等植物中,与木质部的降解作用相关.在大型真菌中,它与色素的形成、子实体
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漆酶(ρ-diphenol oxidase EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶.漆酶具有很多重要的生物学作用:在高等植物中,与木质部的降解作用相关.在大型真菌中,它与色素的形成、子实体的形成、木质素的降解和分生孢子的致病性和脱毒作用有关.本论文从木耳胞外漆酶高产菌株的筛选、胞外漆酶蛋白纯化及漆酶基因克隆等三个方面进行了初步研究,为今后研究漆酶在木耳的生长过程中所起的生物学功能奠定了必要的理论基础.通过对木耳属中的三个种的27个菌株的产过氧化物酶、漆酶能力的检测,从中筛选得到一漆酶高产菌株毛木耳(Auricularia polytricha)AP4,并且对AP4的产漆酶的发酵条件进行了初步研究.对毛木耳AP4的粗酶液进行PAGE电泳后发现含有三种漆酶同工酶(LacA,LacB,LacC),并且通过运用Native SDS-PAGE获得三种漆酶的分子量大小约分别为:LacA(110KD);LacB(84KD);LacC(65KD).对漆酶粗酶液通过硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析进行纯化,用SDS-PAGE证明获得了纯化的单一漆酶LacB,并且对漆酶LacB进行了酶学性质方面的初步研究.根据真菌漆酶基因的保守Cu-bind结构域的氨基酸序列设计简并引物,以毛木耳基因组DNA为模板,经PCR扩增获得了一个204bp的木耳漆酶基因特异性DNA片段.利用获得的木耳漆酶基因特异性片段,设计了一对专一引物,通过RACE方法获得了编码毛木耳漆酶基因的cDNA全长序列;该序列全长为1972bp,运用PCgene软件分析得知它包括一个1860bp的完整阅读框(ORF),从33至1892核苷酸,其编码619个氨基酸,编码的蛋白分子量大小约为68KD,等电点pI约为5.15.利用SignalP V2.0软件分析编码的氨基酸序列发现其N端包括一典型信号肽序列(1-18aa),剪切位点为(GLG-AL).通过应用Scanprosite程序可得出在lacl基因编码的氨基酸序列中含有8个N-糖基化位点(N-X-S/T),天东酰胺残基分别位于氨基酸序列的第46、59、84、214、231、281、308、373处,它们都是潜在的糖基化位点.将获得的漆酶基因lac1的全长cDNA序列,以BamHI和NotI位点装入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导表达了漆酶活性,从而进一步证明了lac1为木耳漆酶基因.
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