论文部分内容阅读
21世纪对海洋生物资源的开发与利用已经成为世界各国高科技竞争的焦点，而对于海洋生物遗传资源的研究与应用尤为重要。海带属（Saccharina）是褐藻纲海带目海带科海藻，是重要的大型经济海藻。海带中的甘露醇、碘等经济成分，目前已广泛应用于医药、海藻化工和农业肥料等行业。褐藻胶和岩藻多糖是海带细胞壁的填充物，在海带中含量高，具有多种生物活性。但是，他们在褐藻中的生物合成途径鲜有研究。因此，研究褐藻胶和岩藻多糖生物合成途径的重要酶基因，将其成果应用到分子辅助育种领域以及揭示藻类进化过程具有重要的意义。磷酸甘露糖异构酶是一种金属酶，可逆催化生物体内果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸之间的相互转化，在GDP-甘露糖的合成中具有重要的作用。而GDP-甘露糖是合成褐藻胶和岩藻多糖的前体物质。长囊水云（Ectocarpus siliculosus）基因组数据中目前已经发现了三个不同的PMI基因（type1），分别命名为PMI1，PMI2和PMI4。本文利用同源扩增的方法，以海带总RNA反转录得到的cDNA为模板，首次获得了“荣福”海带（Saccharina japonica×Saccharina latissima）PMI1和PMI4基因的CDS序列，分别长为1881bp和1020bp，分别编码626和339个氨基酸；以海带总DNA为模板，根据海带基因组数据库数据，设计特异性引物，首次获得了海带PMI2和PMI4的DNA全长。PMI2基因DNA全长为8010bp，由11个外显子和10内含子组成；PMI4基因DNA全长为5347bp，由3个外显子和2内含子组成。此外，对1KP计划中的藻类数据库进行搜索，得到了16个褐藻的32条PMI CDS序列。这些褐藻的PMI基因都属于磷酸甘露糖异构酶的Type1类型，有三个不同的拷贝类型。与已经报道的其他生物的PMI基因的氨基酸序列进行比对，发现褐藻的PMI基因相对保守，有三段保守区，与金属离子结合有关的四个氨基酸残基在褐藻PMI中完全一致，与质子转移相关的四个氨基酸残基在褐藻中有三个完全一致。新发现的褐藻PMI基因与已知的长囊水云的同源性最高；同一物种的不同PMI拷贝类型间的序列相似度较不同物种的同一个类型的序列相似度低，暗示着PMI基因的复制现象可以追溯到这些褐藻的共同祖先时代。本文选择实验得到的海带PMI4基因为目的基因，成功的构建了原核表达载体pET32a-PMI4和分泌型酵母表达载体pPICZαA-PMI4，并分别将两个载体转化到大肠杆菌BL21菌株和巴斯德毕赤酵母X-33菌株。原核表达得到的目的蛋白为58kDa，与预期大小一致，大量的目的蛋白以包涵体的形式存在，只有少数存在于上清中，经过Ni柱纯化得到了重组蛋白。巴斯德毕赤酵母表达得到的目的蛋白大小为37kDa，并没有在发酵液上清中，而是在细胞内，说明目的蛋白并没有在信号肽的指引下分泌到胞外，纯化后蛋白浓度为0.15mg/mL。对巴斯德毕赤酵母表达的蛋白进行酶活性研究，海带PMI4蛋白的活性达到169.7U/mg，得出该酶的最适反应温度为15℃，最适pH为8.5，显示出该酶为低温酶，碱性蛋白。此外，Zn2+、Cu2+和Mn2+对海带PMI4蛋白的酶活性有抑制作用，而Ca2+和Mg2+对酶活基本无影响；Co2+有促进酶活的作用。