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第一部分 Erbin在颞叶癫痫患者及小鼠模型中的表达 目的：课题组前期利用基因芯片及生物信息学技术筛选出一系列与难治性颞叶癫痫发病相关的差异候选基因，发现 Erbin（ ErbB2 interacting protein）基因水平表达上调。本部分实验中我们首先检测Erbin在颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）患者及动物模型中的表达，拟初步探讨Erbin在TLE形成中的可能作用。 方法： 1.从本课题组已建立的耐药性颞叶癫痫脑库中随机抽取30例癫痫患者术后标本和10例外伤行去颅骨瓣减压手术患者颞叶皮质作为对照标本。 2.将雄性成年 C57BL/6小鼠随机分为实验组（n=35）及对照组（n=9），实验组给予匹罗卡品（Pilo）腹腔注射造模，小鼠到达癫痫持续状态（SE）后通过视频监控逐步将出现自发性发作（SRS）的小鼠分笼，再随机分为两个时间点亚组：即1M，2M组。 3.用尼氏染色、免疫组化、Timm染色方法检测TLE小鼠海马组织的神经病理学特性。 4.用免疫印迹、免疫组化、以及免疫荧光双标方法分别检测Erbin在TLE患者及小鼠模型中的蛋白表达水平及细胞定位。 结果： 1.临床标本中：免疫印迹结果显示，Erbin在 TLE患者颞叶皮质中表达较对照组显著升高（P<0.01）；免疫组织化学染色显示，Erbin主要位于TLE组及对照组的神经元胞膜及突起上，少量位于细胞浆。Erbin在TLE组呈强阳性表达，对照组免疫阳性较弱，两组平均光密度值差异具有统计学意义（P<0.01）；免疫荧光双标结果显示 Erbin主要位于TLE患者颞叶皮质神经元上，集中在兴奋性突触后。 2. Pilo致TLE小鼠海马神经病理学特点：尼氏染色结果显示TLE小鼠CA1区神经元排列稀疏，细胞数较对照组显著减少（P<0.05）；免疫组化结果显示TLE小鼠海马CA1区GFAP免疫阳性细胞数较对照组明显增加（P<0.05）；Timm染色结果显示 TLE小鼠海马齿状回内分子层可见浓密的苔藓纤维芽生。说明TLE模型小鼠具有典型的海马硬化病理学特征。 3.动物模型：免疫印迹结果显示，与对照组相比，Erbin在 TLE小鼠慢性期（1M，2M）中表达均增高（P<0.01），而两个时间点组之间相互比较，差异无统计学意义（P>0.05）；免疫荧光双标结果显示Erbin在 TLE小鼠海马中与神经元共表达，主要定位于细胞膜及树突上。 结论： 1. Erbin在TLE患者颞叶皮质和Pilo诱导TLE小鼠模型海马脑组织中表达均增高，细胞定位为兴奋性突触后，提示 Erbin可能参与了TLE的形成过程。 2. Pilo诱导小鼠达到SE后继发癫痫发作，且伴有海马神经元丢失、胶质细胞增生、苔藓纤维芽生，提示Pilo致TLE小鼠模型是一种较为理想的颞叶癫痫模型。 第二部分慢病毒介导RNA干扰沉默Erbin基因对癫痫模型小鼠行为学的影响 目的：为进一步研究Erbin与癫痫的关系，我们构建了沉默Erbin基因的短发卡RNA（sh-RNA）慢病毒载体，通过海马立体定位注射转染病毒拟达到抑制内源性Erbin表达，采用匹罗卡品致TLE模型以及戊四氮慢性点燃模型来观察Erbin干预后引起的小鼠癫痫行为学改变。 方法： 1.根据国外文献报道的沉默Erbin的有效shRNA序列，构建及合成RNAi慢病毒及空病毒对照。将病毒予小鼠海马立体定位注射，7天后通过免疫印迹及共聚焦显微拍照检测病毒转染效率及面积。采用FJB染色观察慢病毒对海马神经元变性坏死的影响。 2. Pilo诱导小鼠达到癫痫持续状态后，将SE后存活下来的小鼠按SE后24h、48h、72h三个时间点随机分组，每组n=4只小鼠用于免疫印迹检测Erbin在SE后急性期的表达水平，以确定SE后病毒干预Erbin的最佳时间。 3. Pilo诱导TLE模型慢性期自发性发作观察：Pilo诱导小鼠达到SE后随机分 LV-Erbin-RANi组及 LV-Erbin组，分别对小鼠进行shRNA-Erbin慢病毒及空病毒注射，同时埋置海马颅内电极，连续27天对小鼠进对视频录像观察发作潜伏期，统计在慢性期（SE后21-30天）小鼠达到4级及以上发作的频率，并通过多通道在体记录系统对自发性发作进行脑电分析。 4.戊四氮慢性点燃模型行为学观察：每天于固定时间给予小鼠戊四氮35mg/kg单次腹腔注射，然后观察1h行为学变化，记录该时间段小鼠发作的最高级别。详细记录两组每只小鼠出现完全点燃的时间（潜伏期），即第一次注射戊四氮至连续3天达到Racine评分4级或以上发作级别的第3天时间（d）。 结果： 1.慢病毒注射后7d后共聚焦显微照片显示，病毒注射侧整个海马组织均表达绿色荧光蛋白（GFP），齿状回区域荧光强度最明显，说明病毒成功转染至海马神经元中；免疫印迹结果显示， LV-Erbin-RNAi组 Erbin表达水平较对照组（Control）及空病毒组（LV-GFP）明显降低（ P<0.05），抑制效率达到64％；FJB染色结果显示：慢病毒组（LV-Erbin-RNAi）海马组织形态结构与对照组（Control）相比无明显差异，两组均未发现明显 FJB阳性细胞。说明我们实验中给予海马注射2μl病毒不会引起神经元变性坏死。 2. SE急性期Erbin表达情况：免疫印迹结果显示，Erbin在SE后海马组织中的表达水平较对照组升高（P<0.05），24h组达到高峰，48h后又开始下降，到3d时平均光密度比值与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。说明SE后3天Erbin表达水平基本恢复到生理水平。 3. Erbin基因沉默后对pilo诱导TLE模型小鼠的自发性发作的影响： （1）病毒注射后通过多通道在体记录系统显示：两组场电位无明显差异，均无明显痫样放电。说明慢病毒本身不导致海马深部脑电痫样放电； （2）27天的视频录像观察到空病毒组（LV-GFP）首次发作时间为13.5±3.74天。慢病毒干预组（LV-Erbin）的首次发作时间为17.8±2.79天，与LV-Erbin组小鼠相比，发作潜伏期明显延长（P<0.05）。 （3）Erbin慢病毒组（LV-Erbin）小鼠发作频率为0.78±0.18次/天，持续时间为18.29±2.13秒/次，空病毒组（LV-GFP）小鼠发作频率为1.22±0.35次/天，持续时间为22.53±2.46秒/次，差异具有统计学意义（P<0.05）。说明Erbin减少能缓解癫痫发作的程度。 4. Erbin基因沉默后对 PTZ慢性点燃发作的进程及发作强度的影响：Erbin慢病毒组（LV-Erbin）与空病毒组（LV-GFP）小鼠在每天的行为学观察时间内发作强度无差异（P>0.05）。两组小鼠完全点燃时间统计结果显示：慢病毒组（LV-Erbin，n=6）点燃所需时间为15.83±5.11天，与空病毒组（LV-GFP，n=6）点燃时间（13.83±5.11）相比潜伏期延长，但差异无统计学意义（P>0.05）。 结论： 1.慢病毒介导RNA干扰能有效抑制小鼠海马中Erbin蛋白水平的表达。 2.抑制海马内源性Erbin表达后能够延缓TLE小鼠癫痫形成，减轻癫痫发作程度。 3.海马Erbin基因沉默后不延长PTZ慢性点燃发作的进程及改变发作强度。 第三部分 Erbin在颞叶癫痫形成中的作用机制研究 目的：我们在之前的行为学结果中发现，Erbin基因沉默后可以使Pilo诱导的TLE模型小鼠在慢性期自发性发作减少，且Erbin定位于海马神经元的树突及兴奋性突触后膜，所以我们进一步观察体内干预Erbin后是否对癫痫小鼠兴奋性突触结构及功能有影响。 方法： 1.采用Pilo诱导SE后第3天，将存活下来的小鼠随机分为癫痫模型组（EP，n=11），模型+空病毒组（EP+LV-GFP，n=11），模型+慢病毒组（EP+LV-Erbin，n=11）。分别给予慢病毒或空病毒双侧海马立体定位注射。另设一组空白对照组（Control，n=8）：小鼠给予生理盐水代替Pilo及病毒注射。 2. SE后30d，用免疫组化和免疫荧光对Erbin sh-RNA慢病毒效率进行检测。 3.用高尔基染色对SE后30d各组小鼠海马齿状回颗粒细胞树突形态进行显色，然后对位于内分子层（IML）、中分子层（MML）以及外分子层（OML）的棘密度进行分段统计。 4.用电子显微镜观察 SE后30d各组小鼠海马齿状回区内分子层（IML）的突触形态结构，并对非对称性的突触密度进行统计分析。 5.用免疫印迹检测EP+LV-GFP组与EP+LV-Erbin组小鼠海马突触后相关蛋白PSD-95、δ-catenin以及ErbB2的表达。同时增加两组正常对照小鼠（Con+LV-GFP与Con+LV-Erbin）不进行Pilo诱导SE处理，直接分别进行shRNA慢病毒以及空病毒干预，7d后处死小鼠行免疫检测突触蛋白的表达。 6.为了观察 Erbin基因沉默后对海马神经元突触功能的影响，将C57BL/6小鼠随机分为对照组（Control），空病毒组（LV-GFP），慢病毒组（ LV-Erbin）三组，分别给予生理盐水、空病毒载体以及LV-Erbin-RNAi海马立体注射。7d后制作海马离体脑片，用全细胞膜片钳技术检测海马CA1椎体神经元的mEPSC及mIPSC的幅值与频率，再进一步观察evoked EPSC以及PPR变化情况。 结果： 1.激光共聚焦显微照片提示SE后30d，慢病毒转染区域主要集中在DG区；免疫组化结果显示：与EP组相比，EP+LV-Erbin组的平均光密度值（OD值）降低（P<0.05）。说明慢病毒在Pilo诱导颞叶癫痫小鼠模型慢性期能有效的抑制Erbin在齿状回区的表达。 2.高尔基染色结果显示：TLE模型慢性期小鼠海马内分子层树突棘密度增加（p<0.05），而内源性Erbin基因沉默后可以使IML区的棘密度减少（p<0.05）；在中分子层（MML）和外分子层（OML）内， TLE模型小鼠的棘密度与对照组比反而减少（p<0.05），且Erbin基因沉默后对该两个区域棘密度变化无影响（P>0.05）。说明 Erbin基因沉默后仅对内分子层内的树突棘密度起调节作用。 3.电镜结果显示：TLE模型小鼠内分子层内突触结构模糊不清，突触前轴突终末及树突棘水肿明显，非对称性突触增多。EP+LV-Erbin组中非对称性突触与对称性突触分布均匀，非对称性突触密度比模型组明显减少（P<0.05）。说明 Erbin基因沉默后能缓解内分子层内异常增多的兴奋性突触联系。 4.突触相关蛋白的表达：在正常小鼠中体内注射慢病毒抑制Erbin表达后可以下调PSD-95、δ-catenin及ErbB2表达（P<0.05）。但在癫痫模型中， Erbin抑制后主要影响了 PSD-95和δ-catenin的变化（P<0.05），尤其是PSD-95表达水平改变最为明显，而对ErbB2无影响（P>0.05）。 5.海马脑片全细胞膜片钳结果显示：各组mIPSC的频率和幅值均无明显差异（P>0.05）；但与对照组和 LV-GFP组相比，LV-Erbin组mEPSC的频率和幅值均减小（P<0.05）；AMPAR介导的eEPSC幅值以及AMPA/NMDA比率也显著减小（P<0.05），但各组NMDAR介导的eEPSC幅值无明显变化（P>0.05），且PPR也无明显变化（P>0.05）。说明Erbin基因沉默后主要影响兴奋性突触功能。 结论： 1. TLE小鼠慢性期（SE后30d），sh-RNA慢病毒能有效的抑制内源性Erbin表达。 2. Erbin表达抑制后可以下调 TLE小鼠海马齿状回颗粒细胞的树突棘密度和兴奋性突触联系，同时下调兴奋性突触后蛋白表达。 3.内源性Erbin减少后能抑制海马CA1区椎体神经元AMPAR介导的兴奋性突触后电流，且这种抑制作用不通过突触前机制，但对GABA介导的抑制性突触后电流不起作用。