论文部分内容阅读
脂联素(adiponectin)是一种在脂肪容量增大时分泌反而减少的白色脂肪组织蛋白。作为一种肥胖负调控因子脂联素在体内的生理作用主要是增加胰岛素敏感性，促进糖脂代谢。脂联素的生物学功能表现在胰岛素抵抗增敏及代谢调节功能;抗炎和血管保护功能;抗心肌缺血和心肌保护功能。心房颤动（atrial fibrillation，AF房颤）是一种常见的房性心律失常。房颤作为一种心律失常，其发生机制绝不仅仅是心房电重构。心房结构重构也是房颤发生、持续的一个重要因素。心房细胞肥大、纤维化是体外细胞房颤模型的重要表现。目前对心房结构重构的分子机制仍缺乏深入了解，有研究显示RAS(renal-angiotensin system)在房颤的心房结构重构中起着重要的作用。作为整个RAS中最重要的生物效应分子，AngⅡ(angiotensinⅡ)能够诱导心肌细胞肥大，AngⅡ慢性刺激能够引起心肌重构和纤维化，模拟心房颤动时结构重构。本论文以原代SD大鼠心房细胞为基础建立房颤模型，通过gAcrp干预肥大纤维化的细胞，深入分析了保护细胞房颤的调节信号通路，为房颤预防和治疗提供新思路。 首先，原代心房细胞形态特征研究和体外房颤模型的建立。体外分离提取心房肌细胞和成纤维细胞，通过原代培养获得活力良好的心房细胞，经过48-72 h原代培养后心肌细胞贴壁80％，搏动频率120-140次/分，搏动呈现同步性，强而有力，节律一致。通过冻存和传代培养后获得稳定增殖的成纤维细胞，心房成纤维细胞也是单层贴壁生长，单个细胞面积较大，呈不规则梭形、菱形或多角形，细胞互相紧密连成一起。心肌细胞和成纤维细胞分别用10μM和1μM的AngⅡ刺激24 h后，通过real-time PCR定量后ANP表达水平升高了1.66倍;COL1A1表达水平升高了1.81倍。AngⅡ刺激后STAT3被激活，磷酸化显著升高，而当用gAcrp预处理后，心肌细胞中P-STAT3降低了48％;成纤维细胞中P-STAT3降低了37％。 其次，原代心房细胞转染体系的建立和靶标基因沉默的研究。通过特殊转染试剂载体携带靶标基因的siRNA进入细胞特异沉默基因表达，分析了脂联素触发的信号通路节点蛋白APPL1和AdipoR1。摸索建立了原代心房细胞转染方案，与空白对照组相比，心肌细胞和心房成纤维细胞中APPL1表达量分别降低了71％和45％;心肌细胞和成纤维细胞中AdipoR1表达量分别降低了75％和66％。蛋白水平上通过western blot分析，APPL1和AdipoR1表达被沉默后，gAcrp激活的P-AMPK也相应地降低。在mRNA水平上real-time定量分析肥大、纤维化指标因子得知，APPL1和AdipoR1表达被沉默后，gAcrp抑制的ANP和COL1A1显著地升高。 最后，全面进一步分析脂联素通过AMPK介导的信号通路。本工作在原代培养的乳大鼠心房细胞Angll诱导心肌细胞肥大纤维化模型基础上，通过gAcrp干预，利用LY294002特异抑制PI3K基因表达，分析信号通路节点PI3K在gAcrp/AMPK/Akt中的作用。当PI3K被特异抑制后，gAcrp启动了AMPK/Akt通路，激活AMPK磷酸化，但Akt并没有被激活。进一步分离提取细胞核蛋白和胞浆蛋白，通过EMSA实验分析了转录因子NF-κB转位情况。结果表明gAcrp通过AMPK介导抑制NF-κB p65向核内的转位，从而逆转了AngⅡ诱导心肌细胞的肥大。