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神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)是一种由36个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统中,尤其在端脑、视前区、视顶盖以及下丘脑含量丰富。在下丘脑内又以弓状核、室旁核、室周核、视交叉上核、视交叉后区等分布密集。NPY具有调节摄食、生长、心血管功能、生殖、应激、免疫应答、激素调节、肥胖、性逆转等生理效应,另外NPY对哺乳动物和鱼类生理节律和性行为也具有调节作用。对NPY进行研究,为研究该基因调节岩原鲤(Procypris rabaudi(Tchang))摄食和生长提供理论依据,为进一步研究岩原鲤的神经内分泌调控机制提供线索。本研究以岩原鲤为试验对象,经PCR条件优化,运用RACE技术克隆岩原鲤NPY基因cDNA的全长编码区序列,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列以及预测的蛋白质高级结构进行了分析。同时,本研究还检测了日粮不同蛋白水平(25%、30%、35%、40%、45%、50%)处理下第1、2和4个月的岩原鲤脑组织中NPY表达水平的变化,揭示了NPY对摄食的调节作用,为鱼类营养学研究提供科学依据。1.在对多种鲤科鱼类的NPY基因进行了多重比对后设计特异性引物,通过RACE技术以岩原鲤脑组织的mRNA为模板扩增获得岩原鲤NPY cDNA的全长编码区序列。从NPY cDNA全长编码区序列扩增结果得到699bp的岩原鲤NPY cDNA序列,包括一个5′非编码区序列长度为10个核苷酸的(5′UTR),起始密码子(ATG),编码96个氨基酸的开放阅读框(ORF)、终止密码子(TGA)和一个包括加尾信号(AATAAA)、poly(A)信号的3′非编码区序列(3′UTR),3′非编码区序列包括398个核苷酸。经同源性比较分析,可以确定试验结果为NPY cDNA序列。2.岩原鲤NPY基因编码96个氨基酸,蛋白预测分子量10892D,等电点pI为5.72。SignalP在线查找发现,NPY编码的第1到第28个氨基酸为信号肽。结构域分析表明,NPY基因在第29个氨基酸到第64个氨基酸之间含有一个PAH(Pancreatic Hormone)结构功能域:在第77个氨基酸到95个氨基酸之间含有一个固有无序化区域。在氨基酸组成上,亮氨酸(Leu)是含量最高的氨基酸(10.42%);其次是丙氨酸(Ala),占9.38%;再次是谷氨酸(Glu)和苏氨酸(Thr),均占7.29%;含量最低的氨基酸为缬氨酸(Val),约1.04%。从整体上来看,碱性氨基酸(赖氨酸Lys、精氨酸Arg)和酸性氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)分别占9.38%和13.5%。岩原鲤NPY的二级结构由α-螺旋、β-折叠、转角和随机卷曲四种形式组成,α-螺旋所占比例最高,β-折叠的比例最低。3.蛋白质序列比对和MEGA4.0聚类分析表明,鲤科鱼类的NPY编码区氨基酸序列具有较高的同源性,其中岩原鲤NPY与其它鲤科鱼类NPY均含有96个氨基酸,与鲤鱼、中华倒刺鲃、斑马鱼、鲫鱼NPY氨基酸序列同源性分别为99.3%、98.5%、97.0%、97.0%。此外,岩原鲤NPY蛋白与其他物种同源性较鲤科鱼类低,如与斜带石斑鱼、舌齿鲈、虹鳟、石纹电鳐、斑点叉尾鮰等的NPY氨基酸序列的同源性分别为88.8%、、87.3%、88.1%、88.1%、71.4%。与七鳃鳗NPY氨基酸序列的同源性最低,只有67.9%。根据岩原鲤与其它物种的NPY氨基酸序列的同源性构建进化树,所得的分类结果与传统的分类结果基本一致。这些结果说明鲤科鱼类NPY在进化过程中保持高度保守性。4.本研究采用单因子试验设计,将300尾试验鱼随机分为6组(对照组,40%蛋白组:25%;30%:35%:45%;50%),用于检测日粮蛋白水平对岩原鲤脑组织NPY表达的影响。在饲养了1和2个月时,日粮25%、30%、35%、45%和50%蛋白组岩原鲤全脑组织NPY基因的表达均显著高于对照组(40%)。饲养1个月后,日粮25%蛋白组与30%、35%、45%和50%蛋白组NPY基因的表达之间差异显著;饲养2个月后,日粮35%和45%蛋白组之间不存在显著差异,但与日粮25%、30%和50%蛋白组差异显著。饲养4个月后,日粮25%和30%蛋白组NPY表达降低,与35%、45%、40%和50%蛋白组NPY表达差异显著。结果表明,蛋白质摄取能调节岩原鲤NPY的表达。