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目的1.以育龄妇女子宫内膜组织标本为研究对象,探讨希佩尔林道(vonHippel-Lindau, VHL)基因和蛋白在人类子宫内膜的表达及其变化,分析VHL基因在人类胚胎着床及胚胎植入过程中的可能作用。2.检测育龄妇女子宫内膜组织中乙酰基转移酶P300/CBP(P300 and cAMP responsive element-binding protein binding protein)和VHL基因甲基化的变化,探讨表观遗传学改变在子宫内膜生理功能中的可能作用。3.以育龄妇女子宫内膜组织标本为研究对象,检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)蛋白和基因的表达及变化,分析人类子宫内膜中HIF-1α表达变化的调控机制。4.观察育龄妇女输卵管组织VHL蛋白和基因的表达及其变化,阐明人类输卵管中是否存在VHL基因及其表达状况,分析VHL蛋白在人类输卵管生理功能中的可能作用。材料与方法1.VHL蛋白与VHL mRNA在人子宫内膜组织中的表达30例既往月经规律、有正常生育史的育龄妇女子宫内膜标本,按月经周期分为增生早期组7例,增生中晚期组8例,分泌早期组6例,分泌中晚期组9例。应用激光共聚焦显微镜法(laser cofocal scanning microscopy, LCSM)观察VHL蛋白在子宫内膜组织的表达(n=3)。应用免疫组化法检测人子宫内膜腺上皮细胞中VHL蛋白表达的平均灰度值(n=30)。采用逆转录聚合酶链反应法(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blotting)检测VHL在人子宫内膜组织中的蛋白和基因表达及变化,与内参照蛋白和内参照基因光密度比值表示VHL蛋白和基因的相对量(n=15)。2.P300/CBP蛋白和VHL基因甲基化在人子宫内膜组织中的表达15例既往月经规律、有正常生育史的育龄妇女子宫内膜标本,按月经周期分为增生期组7例,分泌期组8例。采用Western blotting法检测P300/CBP在人子宫内膜组织中的蛋白表达和变化。应用甲基化特异性聚合酶链反应法检测VHL基因在子宫内膜组织中的甲基化状态。3.VHL、P300/CBP与HIF-1α蛋白在人子宫内膜组织中表达的相关性研究30例既往月经规律、有正常生育史的育龄妇女子宫内膜标本,按月经周期分为增生早期组7例,增生中晚期组8例,分泌早期组6例,分泌中晚期组9例,应用免疫组织化学法检测人子宫内膜组织中的蛋白表达变化。采用RT-PCR法和Western blotting法检测人子宫内膜组织中的HIF-1α蛋白和基因的表达及其变化,应用Pearson相关分析进行统计分析VHL、P300/CBP蛋白与HIF-1α在子宫内膜组织中表达的相关性(n=15)。4.VHL蛋白与VHL mRNA在人输卵管组织中的表达27例既往月经规律、有正常生育史的育龄妇女输卵管标本,按月经周期分为增生早期组15例,增生中晚期组8例,分泌早期组4例,分泌中晚期组9例。采用LCSM法观察VHL蛋白的表达部位,RT-PCR法和Western blotting法检测人输卵管组织中VHLmRNA和蛋白的表达(n=3)。免疫组化法半定量分析VHL蛋白在人输卵管组织中的平均灰度值,单位以PU值表示(n=27)。5.统计学分析免疫组化结果以阳性单位PU值表示,RT-PCR和蛋白印迹结果分别以目的基因与内参基因、目的蛋白与内参蛋白的光密度比值表示。实验数据以Mean±SD表示,采用统计软件SPSS11.5进行分析。结果1. VHL mRNA与VHL蛋白在人子宫内膜组织中的表达RT-PCR和Western blotting结果显示人子宫内膜组织中存在VHL mRNA及VHL蛋白的表达。VHL蛋白表达在子宫内膜上皮(包括腺上皮与腔上皮)细胞的胞浆中,呈弥散性分布。内膜间质细胞也可见阳性表达。随月经周期的变化,在增生早期子宫内膜腺上皮细胞中VHL蛋白表达的PU值最高(3.99±1.68),增生中晚期(3.68±1.31),分泌早期(2.29±0.73),分泌中晚期最低(2.02±0.59),增生期表达高于分泌期,差异有统计学意义(P<0.05)。人子宫内膜组织中VHL mRNA表达也随月经周期发生变化,在增生期增高(1.26±0.46),分泌期降低(0.69±0.28),差异有统计学意义(P<0.05)。2.P300/CBP蛋白和VHL基因甲基化在人子宫内膜组织中的表达人子宫内膜组织中P300/CBP蛋白表达随月经周期变化,增生期增高(0.72±0.27),分泌期降低(0.24±0.19),差异有统计学意义(P<0.05)。子宫内膜组织中VHL基因呈非甲基化状态,未检测出VHL基因甲基化变化。3. VHL、P300/CBP与HIF-1α蛋白在人子宫内膜组织中表达的相关性研究HIF-1α蛋白表达于子宫内膜上皮(包括腺上皮与腔上皮)细胞的胞浆中,内膜间质中也可见阳性表达。随月经周期的变化,上皮细胞中HIF-1α蛋白表达发生变化：HIF-1α表达增生中晚期最高(3.21±0.86),增生早期(2.81±1.01),分泌早期降低(1.83±0.73),分泌中晚期最低(1.63±0.53),增生期表达高于分泌期,差异有统计学意义(P<0.05)。人子宫内膜组织中HIF-1αmRNA表达也随月经周期发生变化,增生期增高(0.86±0.43),分泌期降低(0.32±0.23),差异有统计学意义(P＜0.05)。VHL蛋白与HIF-1α表达呈正相关(P<0.05)。P300/CBP与HIF-1α表达呈正相关(P<0.05)。4. VHL mRNA与VHL蛋白在人输卵管组织中的表达RT-PCR和Western blotting结果显示人输卵管组织中存在VHL mRNA及VHL蛋白表达。VHL蛋白表达于输卵管上皮细胞和间质细胞的胞浆中,间质细胞表达弱于上皮细胞。在月经周期的增生早期,输卵管峡部、壶腹部、伞部VHL蛋白表达的PU值分别是(5.21±4.17)、(4.27±2.26)、(3.58±1.31),增生中晚期分别是(2.99±1.00)、(2.98±0.83)、(4.26±1.03),分泌早期分别是(3.69±1.80)、(3.87±2.78)、(3.33±1.22),分泌中晚期分别是(3.44±1.66)、(3.84±2.52)、(2.88±1.26)。在月经周期的增生早期、增生中晚期、分泌早期和分泌中晚期,VHL蛋白在输卵管的峡部、壶腹部、伞部的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。在月经周期同一时期,输卵管峡部、壶腹部、伞部的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。结论1.人子宫内膜组织中存在VHL mRNA及VHL蛋白表达,且具有周期性变化,推测VHL基因可能参与调节增生期子宫内膜的血管新生平衡。2.子宫内膜的乙酰基转移酶P300/CBP在月经周期中有周期性变化,可能是雌激素诱导正常子宫内膜效应的基础。子宫内膜VHL基因去甲基化状态,VHL基因转录表达,从而参与子宫内膜正常生理活动的调节。3.人子宫内膜组织中存在HIF-1αmRNA及HIF-1α蛋白表达,且具有周期性变化,HIF-1α可能诱导其下游基因表达以维持子宫内膜基本的生理活动。P300/CBP和VHL蛋白调节子宫内膜中HIF-1α的表达。4.人输卵管组织中存在VHL蛋白及VHL mRNA表达。VHL蛋白在输卵管组织的表达不具有周期性变化,VHL蛋白稳定表达可能参与输卵管上皮细胞之间的相互转化。