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阿尔采末病(Alzheimer’s disease, AD,曾译名阿尔茨海默病,又称早老性痴呆)是一种以进行性记忆和认知功能损伤为特征的退行性神经系统疾病,是老年期痴呆中最为常见类型。1906年,德国医生Alosis Alzheimer首次对该病患者的症状和病理改变进行描述,AD因此而得名。AD常发生于65岁以上的老年人群。随着年龄增长,AD发病率迅速增加,在65~74岁人群中AD发病率约为4%左右,而在85岁以上的老年人中,该比例高达50%左右。AD的确切致病机理至今仍无定论,也缺乏对其有效的根治药物。目前的治疗手段仅能有限的缓解AD的部分症状。截至2008年,全球范围内进行了500余项针对AD治疗的临床试验,均未能取得满意的疗效。在欧美等发达国家,每年用于AD患者的费用超过1000亿美元。给患者、家庭和社会都带来沉重的负担。因此,开发对AD有效的干预措施和治疗手段已成为AD研究的热点,也是一个倍受关注的社会问题。AD主要病理特征为脑内细胞外老年斑(senile plaques, SP)沉积、细胞外神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)及大脑皮质等脑区内神经元和突触缺失变性。β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)是AD主要病理改变——SP的主要成分,在体内由淀粉样前体蛋白在β-裂解酶作用下生成。目前的研究认为,脑内神经元胞外Aβ沉积可能是AD致病的核心机制,也是治疗AD的潜在靶点之一。大量研究证实,Aβ具有较强的聚集能力(老化),老化的Aβ纤维具有极强的神经毒性。生理状态下,Aβ生成和清除保持着平衡的稳态。基因突变和环境等因素破坏上述平衡状态,导致Aβ积聚而引发级联反应,造成神经元功能失调并死亡,通过氧化应激、细胞凋亡及促发炎症级联反应等途径引起或促进AD发展。大量研究表明,AD患者认知功能损害与脑内神经元,尤其是大脑皮质和海马神经元大量丢失密切相关,而神经元丢失可能主要是Aβ毒性作用诱导的细胞凋亡所致。凋亡是细胞在发育过程中或在某些因素作用下,通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD),是细胞在特定环境下的主动自杀过程。目前研究认为,细胞凋亡活动过盛可能是导致AD进行性神经病变的重要原因之一。凋亡发生涉及复杂的分子生物学机制,其中半胱氨酸-天冬氨酸特异蛋白酶网络-caspase家族在凋亡过程中发挥着关键作用。Caspase是一类半胱氨酸蛋白酶,正常情况下caspase均以非活性的酶原形式存在于细胞中,凋亡刺激因子可诱导它们逐级水解活化,启动caspase级联反应,特异性水解一系列蛋白质底物,导致细胞凋亡。目前已发现caspase家族蛋白成员至少有14个,其中caspase-3是各种细胞凋亡通路的最终执行者,被称作细胞凋亡的“终结者”。根据凋亡启动与传导通路可以把细胞凋亡途径大致分为2类,即死亡信号-受体途径和线粒体途径。大量体外实验表明Aβ可能主要通过线粒体途径引起神经元的凋亡。Aβ刺激线粒体膜并导致其通透性增加,位于线粒体膜内的细胞色素C(cytochrome c, Cyt-c)释放到细胞质中,作为凋亡诱导因子,Cyt-c能在ATP/dATP存在的条件下与凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor 1, Apaf-1)结合,诱导Apaf-1自身多聚化形成8亚基单位的Apaf-1多聚体,通过N端粘附caspase-9前体形成凋亡体,然后召集并激活caspase-3,进而引发caspases级联反应,导致细胞凋亡。近年来,大量研究表明神经甾体对治疗包括AD在内的神经退行性疾变具有重要的意义。内源性神经甾体是由脑组织(神经元和胶质细胞)在各种甾体生成酶的作用下经胆固醇或自外周循环进入神经系统的各种前体合成的一类甾体物质的总称。它们具有广泛的生物学活性,被视为第四代神经递质,是近20年来最为引人注目的一类神经保护剂。其中主要的神经甾体包括孕烯醇酮(pregnenolone,PREG)及其硫酸酯(pregnenolone sulfate,PREGS)、脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)及其硫酸酯(dehydroepiandrosterone sulfate,DHEAS)、孕酮(progesterone,PROG)及别孕烯醇酮(allopregnanolone,AP)等。在对AD患者进行尸检时发现其脑内神经甾体水平下降的现象,同时AD患者脑内的关键致病蛋白(如Aβ等)增多,由此推测神经甾体可能参与了AD的发病过程,提示它们对AD可能具有保护作用。另有体外研究发现,PREG和DHEA能够通过抗自由基氧化、抑制糖皮质激素受体(glucocoticoid receptor, GR)活性等机制对抗Aβ引起的神经毒性作用,减少神经细胞死亡。有人提出假说,高浓度Aβ可能通过抑制具有神经保护作用的内源性神经甾体合成而引起神经毒性。虽然部分神经甾体(如PREG和DHEA)已显示出对抗Aβ神经毒性的作用,但目前对内源性神经甾体参与调节AD病变时的细胞机制还知之甚少,尤其是对Aβ损伤神经细胞时脑内神经甾体合成与代谢的变化情况缺乏足够了解。在神经系统中,PREG和DHEA均处于神经甾体合成代谢的上游,是合成其它神经甾体的前体物质,它们所表现出的神经保护作用可能是其本身和其下游神经甾体作用的共同结果。此外,神经甾体的神经保护作用还可能涉及更多的机制,如调节各种细胞膜受体的活性、影响细胞质内各种细胞器的功能及调节各种细胞内受体和因子。目的:以原代培养的大鼠皮质神经元方法为基础,采用Aβ活性片断Aβ25-35体外诱导损伤神经元建立AD细胞模型;采用固相萃取结合HPLC-MS方法对Aβ25-35诱导的AD模型神经元损伤时主要神经甾体PREG、DHEA、PROG及AP合成代谢水平的变化进行研究;以Aβ25-35损伤大鼠皮质神经元时神经甾体合成与代谢通路中发生显著改变的PROG和AP为干预物质,探讨它们对Aβ25-35诱导的神经元毒性作用的影响,并进一步探讨PROG保护神经元对抗Aβ的神经毒性的作用和机制,旨在为AD的预防和治疗提供新思路。方法:1大鼠大脑皮质神经元原代培养与形态观察取新生SD大鼠的大脑皮质,采用胰蛋白酶消化辅以机械分离法分离细胞,悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,调整活细胞密度为1.0×109 L-1,接种于预先包被L-多聚赖氨酸的培养板中,在37oC,5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中孵育,24 h后首次换液为neurobasal培养基,以后每隔两天半量换液。取培养8~10 d的神经元细胞供实验用。倒置显微镜下观察神经元细胞形态学变化。2细胞样品收集与定量收集加药处理后的细胞,加入裂解液裂解细胞,离心收集上清,紫外法测定蛋白质浓度。3 MTT法检测细胞存活率将细胞接种于96孔板,培养8~10 d,加药处理后,每孔加入20μL MTT液(3.6 mmol·L-1),37℃孵育4 h,弃上清,加入200μL DMSO溶解甲瓒结晶,以空白孔调零,用读板机测定570 nm波长处的吸收度值,以空白对照组吸收度的均值为100%,用各样本吸收度值/空白对照组吸收度的均值计算该样本细胞的存活率。4细胞培养液中乳酸脱氢酶活性的测定收集各组细胞培养上清液,用乳酸脱氢酶测试盒,紫外分光光度法测定440 nm波长处的吸收度值,计算乳酸脱氢酶的活力以对照组乳酸脱氢酶的活力的均值为100%,用各样本乳酸脱氢酶的活力值/空白对照组吸收度的均值计算该样本细胞的乳酸脱氢酶的活力。5固相萃取结合LC-MS法测定培养液中主要神经甾体的水平取收集的细胞液1 mL,加入内标甲睾酮(methyltestosterone, MT,浓度为50μg·L-1)及甲醇各100μL,固相萃取法进行样品提取,样品经2-硝基-4-三氟甲基苯肼(2-nitro-4-trifluoromethylphenylhydrazine, 2NFPH,浓度为0.10 g·L-1)衍生化反应1 h,氮气吹干,残渣用100μL乙腈复溶后置样品瓶中,进样20μL用于HPLC-MS分析。采用液相色谱-质谱联用法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)测定PREG、DHEA、PROG和AP的浓度。HPLC条件:分析柱为Thermo BDS Hypersil C18柱(5μm,2.1 mm×150 mm),保护柱为Aglient Zorbax SB C18柱(5μm,4.6 mm×12.5 mm),流动相为乙腈-水,梯度洗脱(1~3 min,70%乙腈;3~6 min,80%乙腈;6~10 min,100%乙腈;10~15 min,70%乙腈),流速1 mL·min-1,柱温为40℃。MS检测条件:大气压化学离子化(air pressure chemical ionization, APCI)源,毛细管电压4.0 kV,氮气流速7 L·min-1,雾化气压力为350 kPa(50 psi),干燥气温度为350℃,负离子检测,碎片电压为150V。用于选择离子监测(SIM)定量分析的离子分别为m/z 518(PREG-2NFPH,[M-H]-)、m/z 490(DHEA-2NFPH,[M-H]-)、m/z 719(PROG-2(2NFPH),[M-H]-)、m/z 520(AP-2NFPH,[M-H]-)及m/z 504(MT-2NFPH,[M-H]-)。6 Hoechest 33342核染色法检测神经元凋亡取分组加药处理后的神经元细胞,弃去培养基,用冷生理盐水冲洗,加入4%多聚甲醛固定,弃固定液,用冷生理盐水冲洗3遍,加入Hoechest33342(5 mg·L-1)染色5 min,再用生理盐水漂洗2遍,荧光显微镜下,随机选取6个视野/孔(每个视野100个细胞)进行形态观察和计数,计算凋亡率。7 Western-blot检测胞浆中Cyt-c、caspase-9及caspase-3蛋白表达取分组加药处理后的神经元细胞,于药物处理结束立即将培养板置于冰上,移去培养液,收集细胞,提取胞浆蛋白,-80℃备用。将各待测样品与等体积的变性缓冲液混合,煮沸10 min,冷却至室温。样品经不同浓度的SDS-PAGE电泳分离,200 mA湿法转,加脱脂奶粉封闭,加一抗4℃孵育过夜,TBS漂洗后加辣根过氧化物酶标记的二抗IgG-HRP室温孵育2 h,ECL光化学法显色,暗室中压X光片显影。结果经凝胶成像分析系统分析扫描,测定各条带积分光密度,以目的蛋白与β-actin积分光密度值的比值表示。8数据处理与统计分析数据结果均以±s表示。采用SPSS 14.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。量效关系采用二元变量相关分析,计算Pearson相关系数,统计结果以P<0.05为具有显著性差异。结果:1 Aβ25-35对原代培养大鼠皮质神经元的损伤作用1.1 Aβ25-35损伤大鼠大脑皮质神经元时细胞的形态学改变倒置显微镜下,原代培养8 d的神经元多呈梭型或锥形,少数呈多边形,胞体饱满,胞浆丰富,核大,核仁隐约可见;部分细胞聚集成团,突起增多并延长,相互交织形成网络。与对照组比较,1 mmol·L-1 Glu处理24 h后神经元细胞数量明显减少,部分细胞胞体肿胀,失去折光性,胞质内出现颗粒及空泡,部分神经元细胞膜破裂,大量碎片生成。Aβ25-35处理24 h后神经元细胞数量随着Aβ25-35浓度的增加呈明显减少趋势,胞体肿胀、折光性降低,内有颗粒、空泡,其中1μmol·L-1 Aβ25-35处理组神经元细胞数量与Glu组大体相当,高剂量(10μmol·L-1 Aβ25-35)组的神经元细胞数量较Glu组明显减少,胞体明显缩小,折光性显著下降,胞质内有大量颗粒形成,大部分细胞膜破裂,生成碎片。1.2 Aβ25-35对神经元细胞存活率的影响采用MTT法检测,与对照组比较,1 mmol·L-1 Glu处理造成大鼠皮质神经元细胞明显损伤,细胞的存活率为(53.1±5.5) %(P<0.01);0.1μmol·L-1、1μmol·L-1及10μmol·L-1 Aβ25-35处理均可致大鼠皮质神经元细胞的存活率显著降低,在上述浓度范围Aβ25-35浓度与细胞存活率间存在明显的量效关系,Pearson相关系数为r = -0.897(P<0.01),其中1μmol·L-1 Aβ25-35处理组的存活率为(52.7±3.0) %,神经元损伤程度与1 mmol·L-1 Glu相当(P>0.05)。1.3 Aβ25-35对神经元细胞LDH外漏的影响对照组培养液中LDH活力的检测值为(23.6±2.3) U·g-1 Prot。与之相比,1 mmol·L-1 Glu处理可引起大鼠皮质神经元细胞LDH漏出显著增多,培养液中LDH活力值为(39.9±2.9) U·g-1 Pro(tP<0.01);Aβ25-35 0.1μmol·L-1和1μmol·L-1处理组培养液中LDH活力值与对照组比较均无统计学意义,分别为(23.5±1.4) U·g-1 Prot和(24.7±1.3) U·g-1 Prot(P>0.05);10μmol·L-1 Aβ25-35组的LDH漏出率与Glu组相当,为(38.8±2.0) U·g-1 Prot(P>0.05)。2 Aβ25-35对大鼠皮质神经元神经甾体水平的影响2.1 Aβ25-35对神经元细胞的损伤作用经MTT检测,与对照组比较,1μmol·L-1 Aβ25-35处理24 h后神经元存活率明显降低,为(49.3±4.3) %(P<0.01);胆固醇处理组神经元存活率为(98.6±7.7) %,与对照组比较未见明显改变(P>0.05);但Aβ+胆固醇组的神经元存活率为(83.6±5.1) %,显著高于Aβ处理组(P<0.01)。2.2 Aβ25-35对神经元细胞合成神经甾体的影响对照组及Aβ处理组因未加入神经甾体合成必需的底物胆固醇,均未测得各种神经甾体。胆固醇底物组及胆固醇合用Aβ组DHEA的浓度均低于最低定量限(lower limit of quantization, LLOQ)。胆固醇底物组PREG、PROG及AP的含量分别为(1.3±0.2)μg·g-1 prot、(26.2±2.3)μg·g-1 prot及(10.1±0.8)μg·g-1 prot;胆固醇合用Aβ组PREG、PROG及AP的含量分别为(1.1±0.1)μg·g-1 prot、(18.4±1.2)μg·g-1 prot及(15.3±1.0)μg·g-1 prot。与胆固醇组比较,Aβ25-35处理后神经甾体PREG水平未见明显改变(P>0.05),但PROG水平下降了29.8%(P<0.01),AP水平增高了51.5%(P<0.01)。3孕酮及别孕烯醇酮处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元损伤作用的影响3.1 PROG处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元损伤作用的影响倒置显微镜下观察,与对照组比较,模型组(1μmol·L-1 Aβ25-35处理)神经元细胞数量明显减少。不同浓度的PROG与Aβ25-35共孵育24 h后神经元细胞数量随着PROG浓度升高呈明显增加趋势。经MTT法检测,与对照组比较,模型组大鼠皮质神经元明显损伤,细胞的存活率为(56.7±4.1) %(P<0.01) ;与模型组比较,在0.001μmol·L-1 ~0.1μmol·L-1范围内,PROG与Aβ25-35共孵育大鼠皮质神经元细胞的存活率呈显著增加趋势,在上述范围内,PROG浓度与细胞存活率间存在明显的量效关系,Pearson相关系数为r = 0.757 (P<0.01);其中0.1μmol·L-1 PROG处理组的细胞存活率为(100.7±7.9) %,与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。3.2 AP处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元损伤作用的影响与对照组比较,模型组神经元细胞数量明显减少。随着AP浓度升高,AP与Aβ25-35共孵育24 h后神经元细胞数量与模型组比较大体相当,未见明显增加趋势。经MTT法检测,与对照组比较,模型组大鼠皮质神经元明显损伤,细胞的存活率为(50.9±3.9) %(P<0.01) ;与模型组比较,在0.001μmol·L-1 ~0.1μmol·L-1范围内,不同浓度的AP与Aβ25-35共孵育大鼠皮质神经元细胞的存活率呈显著降低趋势,在上述范围内,AP浓度与细胞存活率间存在明显的量效关系,Pearson相关系数为r = -0.841 (P<0.01)。4孕酮处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元细胞凋亡的影响4.1 PROG处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元细胞的保护作用倒置显微镜下观察,与对照组比较,模型组神经元细胞数量明显减少,经MTT法检测,模型组神经元细胞的存活率为(47.9±2.9) % (P<0.01)。与模型组比较,不同浓度的PROG与Aβ25-35共孵育24 h后神经元细胞数量随着PROG浓度升高呈明显增加趋势,在上述范围内,PROG浓度与细胞存活率间存在明显的量效关系,Pearson相关系数为r = 0.779 (P<0.01);其中0.1μmol·L-1 PROG处理组的细胞存活率与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。4.2 PROG处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元细胞凋亡的影响荧光显微镜下观察,对照组细胞核内多呈弥散均匀的淡蓝色荧光,内有较深的蓝色颗粒;有少量调亡细胞的细胞核呈分叶、碎片状,部分边集,呈亮蓝色。模型组调亡细胞明显增多;不同浓度的PROG与Aβ25-35共处理24 h后神经元调亡细胞数量随着PROG浓度升高呈明显减少趋势。对照组的细胞凋亡率为(11.7±0.8) %,模型组的细胞凋亡率明显增多,为(52.0±5.1) % (P<0.01)。与模型组比较,在0.001μmol·L-1 ~0.1μmol·L-1范围内,PROG浓度依赖地减少大鼠皮质神经元的细胞凋亡率,其浓度与细胞凋亡率的Pearson相关系数为r = -0.887 (P<0.01),其中0.1μmol·L-1 PROG组的细胞凋亡率为(11.8±1.2) %,与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。4.3 PROG处理对抗Aβ25-35引起的神经元细胞损伤时caspase-3水平的变化采用western-blot检测,模型组胞浆caspase-3表达水平为(5.84±0.51),明显高于对照组(3.47±0.26, P<0.01)。与模型组比较,在0.001μmol·L-1 ~0.1μmol·L-1范围内,PROG处理可浓度依赖地降低caspase-3水平,Pearson相关系数为r = -0.904 (P<0.01),其中0.1μmol·L-1 PROG组的caspase-3水平为(3.58±0.21),与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。5孕酮处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元损伤时线粒体凋亡途径相关蛋白表达的影响5.1 PROG处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元细胞的保护作用倒置显微镜下观察,与对照组比较,模型组神经元细胞数量明显减少,经MTT法检测,模型组神经元细胞的存活率为(51.9±4.5) % (P<0.01)。与模型组比较,随着PROG浓度升高,PROG处理组的神经元细胞数量呈明显增加趋势,在上述范围内,PROG浓度与细胞存活率间存在明显的量效关系,Pearson相关系数为r = 0.860 (P<0.01);其中0.1μmol·L-1 PROG处理组的细胞存活率与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。5.2 PROG处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元胞浆中Cyt-c表达水平的影响采用western-blot检测,模型组胞浆中Cyt-c表达水平为(4.58±0.39),显著高于对照组(2.86±0.23, P<0.01)。与模型组比较,在0.001μmol·L-1 ~0.1μmol·L-1范围内,PROG处理能浓度依赖地抑制Aβ25-35诱导产生的Cyt-c表达水平上调,Pearson相关系数为r = -0.850 (P<0.01),其中0.1μmol·L-1 PROG组胞浆中Cyt-c表达水平为(2.98±0.19),与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。5.3 PROG处理对Aβ25-35诱导的AD模型神经元胞浆中caspase-9表达水平的影响western-blot检测显示,模型组胞浆中caspase-9表达水平为(4.99±0.42),显著低于对照组(6.00±0.46, P<0.01)。与模型组比较,在0.001μmol·L-1 ~0.1μmol·L-1范围内,PROG处理可浓度依赖地抑制caspase-9水平下调,Pearson相关系数为r = -0.836 (P<0.01),其中0.1μmol·L-1 PROG组的caspase-9水平为(5.99±0.35),与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。结论:1.本研究考察了Aβ活性片断Aβ25-35对原代培养大鼠皮质神经元的损伤作用,建立了Aβ25-35体外诱导神经元损伤的AD细胞模型。采用1μmol·L-1 Aβ25-35处理24 h可致神经元细胞形态发生明显改变;经MTT法检测,神经元存活率降低50%左右。2.建立了灵敏、简便、可靠的固相萃取结合HPLC-MS法,可同时分析测定细胞培养液中4种主要神经甾体PREG、DHEA、PROG及AP的浓度,适用于体外培养的神经元细胞神经甾体合成代谢变化的相关研究。3. Aβ25-35致神经元损伤时PREG-PROG-AP合成代谢通路发生明显改变,PROG生成显著减少,AP生成显著增多,提示选择性地应用上述神经甾体处理或对相关酶活性进行调节,恢复由Aβ引起的神经元内各种神经甾体水平的失衡,可能对Aβ诱导的神经毒性具有积极的作用。4. PROG能浓度依赖地抑制Aβ25-35诱导的神经毒性作用,提高细胞存活率;而其代谢物AP能浓度依赖地加重Aβ25-35引起的神经元存活度降低,不能产生对抗Aβ25-35神经毒性的保护性作用。5. Aβ25-35可通过诱导激活神经元凋亡途径导致神经元存活率降低。PROG能浓度依赖地抑制Aβ25-35诱导的神经元细胞凋亡,抑制胞浆caspase-3表达水平上调,对Aβ诱导的神经元损伤产生保护作用。6. PROG能通过抑制线粒体凋亡途径的激活,浓度依赖地抵制Aβ25-35诱导产生的Cyt-c表达水平上调及caspase-9表达水平下凋,对抗Aβ诱导的损伤作用,保护神经元。提示抑制粒体凋亡途径激活可能是PROG对Aβ诱导的神经元损伤产生保护作用的机制之一。