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长非编码RNA(lncRNA)Gtl2是位于Dlk1-Dio3印记基因簇上的印记基因,具有母本表达而父本印记的印记模式,对于小鼠胚胎发育具有重要的作用。目前对于lncRNA Gtl2在小鼠胚胎发育中的调节作用没有明确的结论,两项针对Gtl2基因的敲除研究给出了互相矛盾结果。虽然在两篇文章中均出现了胚胎致死表型,证明了Gtl2是对小鼠胚胎发育及其重要的基因,但报道的致死时间与致死机制彼此不同,大规模的基因敲除会删除Gtl2-DMR与mi RNA等重要原件是造成结果矛盾的一条重要原因。此外,有大量的研究表明lncRNA的基因序列具有调控作用,基因敲除会混淆基因序列与lncRNA本身的功能,带来不可靠结果,不适用于lncRNA功能的研究。本研究采用了poly A转录终止法结合Easi-CRISPR技术,构建Gtl2转录终止的小鼠模型,在不删除任何DNA序列的情况下,达到基因敲除等同的效果。深度分析Gtl2的基因序列与转录本信息,将sg RNA的选择范围固定在前三个外显子和前两个内含子序列当中,选择较低活性无功能的DNA区域作为sg RNA靶向位点,避开对调控元件的破坏。根据Easi-CRISPR技术所需要的donor设计原则装配ss DNA donor,通过体内与体外编辑的方式验证sg RNA指导Cas9蛋白编辑基因组的能力,同时检测ss DNA donor中3×poly A序列的转录终止能力。采用原核注射的方式对B6D2F1品系小鼠的受精卵及进行编辑,手术法移植囊胚至代孕小鼠的子宫中,成功获得5只带有阳性插入片段的F0代小鼠,无脱靶现象,成功构建出GTR-poly A小鼠模型。遗传学杂交显示,没有纯和小鼠出生,而且出生幼鼠的基因型比例严重偏离孟德尔遗传定律。此外,本研究优化了基因插入体系,探究了显微注射方式与注射时机对基因敲入效率的影响。设计了5种可能提高基因插入效率的注射方式:受精卵胞质注射(1CC)、受精卵原核注射(1CN)、2-细胞期双胞质注射(2CDC)、2-细胞期单核注射(2CMN)和2-细胞期双核注射(2CDN)。通过每组3次的重复实验总结出,采用原核注射的方式可以得到最高为67%的基因插入效率,而且2-细胞对受精卵进行显微注射的效果会优于受精卵胞质注射。综上,本课题制作了GTR-poly A小鼠模型,遗传杂交实验结果严重偏离了理论比例,提示了lncRNA Gtl2的重要作用,为证实lncRNA Gtl2对小鼠发育的功能奠定了基础。