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细胞穿膜肽是一种能够自主并携带多种货物分子进入细胞的短肽，具有低生物毒性、高运载效率、高生物相容性、能够突破血脑屏障等多种优势，是近20年来迅速发展的一种新型药物载体。然而，细胞穿膜肽的研究和应用中也面临着一些问题。第一，细胞穿膜肽的穿膜机制目前尚没有得到完全的认识。第二，在体应用细胞穿膜肽时往往选择更加稳定的D型穿膜肽，但是D型穿膜肽的毒性更大，同时手性变化对于穿膜肽性质的影响也存在争论。第三，也是令研究者最关注的一点，在应用细胞穿膜肽转运货物分子进入细胞时，特别是在在体水平给药时，货物分子会被困在囊泡(胞吞泡)中无法行使功能甚至被降解失活，从而降低了转运药物分子的实际效力。目前，尚无在体水平实现细胞穿膜肽于胞质中直接投递的报道。在在体水平实现无囊泡束缚的、直接的胞内投递已成为当前细胞穿膜肽发展应用的一个重要热点。针对上述问题，本文构建了一类混合不同比例D/L型精氨酸的新型寡聚精氨酸类穿膜肽，系统分析了该系列穿膜肽在不同孵育环境下的穿膜性质，总结了D型氨基酸对于富含精氨酸类穿膜肽的穿膜性质的影响规律。基于这种规律，本文从这一系列穿膜肽中筛选得到了一种同时具有低生物毒性和高穿膜效率的寡聚精氨酸穿膜肽；基于该穿膜肽，本文首次实现了在体给药后的细胞穿膜肽无囊泡束缚的胞内直接投递。进一步的，依赖于这一系列具有不同穿膜性质的穿膜肽，本文对这类新型寡聚精氨酸细胞穿膜肽的穿膜机理进行了系统研究和阐述。本文具体研究内容如下：(1)为了系统研究氨基酸手性变化对于细胞穿膜肽的影响，本文构建了一类基于混合D/L型精氨酸的新型寡聚精氨酸穿膜肽系列，并对其进行表征。(2)分析了不同条件下，该系列穿膜肽的亚细胞分布、穿膜效率、生物毒性（包括细胞毒性和系统毒性）和生物稳定性（包括酶稳定性和血清稳定性）。总结了D型精氨酸对于这类穿膜肽的穿膜性质变化的影响规律。依据于这种规律性，在所设计的细胞穿膜肽系列中筛选获得了一种同时具有高穿膜效率、低生物毒性，以及能够分别在细胞水平和活体水平实现胞质内直接投递的细胞穿膜肽(rR)3R2。(3)通过对细胞穿膜肽穿膜机制的系统研究，证明富含精氨酸类的细胞穿膜肽具有2种独立的穿膜机制：胞吞作用穿膜机制及特殊的直接穿膜机制。其中，直接穿膜机制是一种依赖于细胞能量和细胞膜电位的从细胞膜边缘开始的快速穿膜过程。基于该机制，穿膜肽能够从细胞膜边缘开始，直接进行胞质内投递，并在细胞内弥散均匀分布。