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目的:
HIV感染直接攻击人体免疫系统,造成CD4+T细胞进行性下降,免疫系统异常活化。调节T(Regulatory T,Treg)细胞对激活应答低,具有免疫抑制功能,可有效调节免疫系统活化,在HIV感染疾病进展中发挥重要作用,但由于研究人群及细胞标志物的差异,目前对HIV感染者Treg细胞数量、比例及活化水平与疾病进展关系的报道存在差异。HVEM(herpesvirus-entry mediator)是Treg细胞表面重要分子,对Treg细胞免疫抑制性及无能性均具有重要意义,Treg细胞能否通过HVEM的表达,调控机体免疫应答而影响HIV感染疾病进展?本研究采用CD4+CD25+CD127low/-及CD4+CD25+FoxP3+两种组标志物定义Treg细胞,分析HIV感染者Treg细胞数量、比例及活化水平随疾病进展的变化,首次检测并比较HIV感染者Treg细胞表面HVEM表达与健康人的差异,并分析了其与疾病进展的相关性及变化的原因。
方法:
1、研究对象
43例无症状HIV慢性感染者(以下简称HIV组)均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊,感染途径多为男男性接触,经本实验室病毒序列分析病毒以CRF01_AE亚型为主,感染时间一年以上,在检测时蚓点尚未接受HAART治疗,按CD4+T细胞数量分为高(CD4+T≥400/ul)、中(200/ul＜CD4+T＜400/ul)、低(CD4+T≤200/ul)三组。14例健康对照(以下简称NC组)为随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人。
2、Treg细胞比例、绝对值及活化水平检测
分别以CD4+CD25+CD127low/-(以下简称CD127low/-Treg)及CD4+CD25+FoxP3+(以下简称FoxP3+Treg)两组标志物定义并检测Treg细胞。密度梯度离心法提取研究对象外周血单个核细胞(PBMC),向CD127low/-Treg样本管加入抗CD3、CD4、CD25、CD127、CD62L的荧光抗体,向同型对照管加入相应荧光标记的同型对照抗体,冰上避光染色45分钟,洗涤及固定细胞;复苏冻存的PBMC,向FoxP3+Treg样本管加入抗CD3、CD4、CD25标记的荧光抗体,向同型对照管加入相应荧光标记的同型对照抗体,冰上避光染色45分钟,沈涤细胞,按Treg细胞破膜染色试剂盒标准操作进行细胞破膜、胞内染色(抗FoxP3标记的荧光抗体),沈涤并固定细胞。使用BD LSRⅡ流式细胞仪及BD FACSDiva TM软件检测并分析CD127low/-及FoxP3+Treg细胞占CD4+T细胞比例,计算其与该样本的CD4+T细胞绝对值检测结果的乘积即得到Treg细胞绝对数量。
3、Treg细胞HVEM表达检测
在Treg细胞检测及同型对照管表面染色步骤中分别加入抗HVEM荧光抗体及相应荧光标记的同型对照抗体,冰上避光染色45分钟,洗涤并固定细胞,使用BD LSRⅡ流式细胞仪及BD FACSDiva TM软件检测并分析CD127low/-Treg细胞表面HVEM的表达情况。
4、Treg细胞体外激活及HVEM动态表达检测
以0.5ug/ml浓度抗CD3单克隆抗体包被U底96孔细胞培养板,封板,4℃过夜,使用前PBS沈板3次。复苏冻存的PBMC、计数并以0.5*106/孔加入细胞培养板并调整体积至200ul,同时设无刺激对照孔。分别于刺激后0、3、6、12、24、48、72小时等七个时间点收获细胞并进行表面染色,使用BD LSRⅡ流式细胞仪检测Treg细胞HVEM表达情况并绘制动态表达曲线。
5、Treg细胞HVEM功能试验
密度梯度离心法提取人PBMC,采用FACSAria流式细胞仪分选CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞及CD3+/CD4+(CD4)或CD3+/CD41(CD8)效应(T effective,Teff)细胞。将Treg细胞HVEM多克隆抗体或对照抗体孵育,离心沈去未结合的抗体。将封闭HVEM的Treg细胞以1:1比例分别与两种Teff细胞混合,加入抗CD3单克隆抗体包被的96孔细胞培养板,培养24小时,于收获前10小时加入golgi stop。收获并进行胞内细胞因子染色(ICS),流式检测Teff细胞IFN-γ表达。
6、CD4+T细胞绝对值检测
将20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中,逆向加入50μl混匀的抗凝全血,室温避光染色15分钟,加入1×免洗溶血素450μl,室温避光溶血15分钟,应用FACS Calibur流式细胞仪及MultiSET软件检测并分析得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。
7、HIV病毒载量测定
以1100μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司TheCOBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)HW-1 Test试剂盒在Roche COBAS(R)AmpliPre(R)上提取核酸后手工转移到COBAS(R)TaqMan(R)系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。
8、统计学分析
应用SPSS17.0软件包进行统汁分析,数据以中位数表示,两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U非参数检验,相关性分析采用Spearman秩相关检验,P＜0.05为有统计学意义。
实验结果:
1、HIV感染者Treg细胞比例、绝对数量及活化水平
HIV组CD127low/-Treg细胞数量明显低于NC组(P＜0.001),Treg细胞比例与健康对照无显著性差异,但随CD4+T细胞的下降呈明显上升趋势,在CD4+T细胞低组中上升明显,较健康对照具有显著性差异(P=0.033)。FoxP3+Treg细胞检测结果同样显示,HIV组FoxP3+Treg细胞数量明显低于NC组(P＜0.001),比例与NC组无明显差异,亦呈上升趋势,CD4+T低组上升显著,比例明显高于CD4+T细胞高组及健康对照(P=0.040,P=0.046)。比较两种表型Treg细胞,我们发现HIV感染者CD127low/-与FoxP3+Treg细胞数量及比例均具有强相关性(数量:r=0.893,P＜0.001;比例:r=0.649,P＜0.001)。通过对Treg活化水平的检测,我们发现HIV组Treg细胞CD62L平均几何荧光强度明显低于NC组(P=0.007)。
2、HIV感染者Treg细胞HVEM表达情况
采用流式检测发现,HIV组Treg细胞HVEM几何平均荧光强度显著低于NC组(P=0.014)。比较HIV及NC两组CD62L+及CD62L-亚群Treg细胞HVEM表达情况,发现HIV组CD62L+及CD62L-两亚群的表达均明显下降,在CD62L-亚群下降更显著(CD62L+:P=0.006;CD62L-组:P＜0.001)。
3、HIV感染者Treg细胞HVEM动态表达
体外非特异性TCR刺激,观察Treg细胞HVEM的动态表达情况显示,与未刺激对照相比,Treg细胞HVEM的几何平均荧光强度呈活化早期下降,2-3天后表达回升的变化趋势。
4、封闭Treg细胞HVEM对Teff细胞分泌功能的影响
分选健康人Treg及Teff细胞共培养,发现Treg细胞能显著抑制CD4+及CD8+Teff细胞活化(P=0.024,P=0,042),降低其IFN-γ产量,分选并封闭Treg细胞表面HVEM,Treg对Teff细胞抑制能力下降,Teff细胞IFN-γ产生量增加。
5、HIV感染者Treg细胞及HVEM与CD4+T细胞数量、HIV病毒载量相关性
HIV感染者CD4+T细胞数量及HIV病毒载量检测结果显示,Treg细胞数量与CD4+T细胞数量显著正相关(r=0.718,P＜0.001),与病毒载量无显著相关性;Treg细胞比例与CD4+T细胞数量及HIV病毒载量相关性均无统计学意义,但表现出随病毒载量增加而上升的趋势(r=0.257,P=0.096);Treg细胞HVEM表达与CD4+T细胞数量及HIV病毒载量相关性缺少统计学意义,但呈随病毒载量升高而下降的趋势(r=0.288,P=0.061)。
结论:
1、HIV组CD4+CD25+CD127low/-及CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量均下降、比例及活化水平上升,较NC组具有显著性差异。
2、HIV感染者Treg细胞表面HVEM表达水平下降,CD62L+及CD62L-两亚群HVEM表达均降低,较健康对照具有显著性差异。
3、体外非特异性刺激,Treg细胞HVEM的表达出现活化早期下降,后期回升的动态表达过程,提示活化水平可以影响HVEM的表达。
4、体外分选并封闭Treg细胞表面HVEM使Treg对Teff细胞抑制功能下降,提示HVEM是Treg细胞抑制机制之一。
5、HIV感染者Treg细胞数量与CD4+T细胞数量显著正相关,比例呈随HIV病毒载量增加丽上升的趋势;Treg细胞HVEM的表达出现随病毒载量升高而下降的趋势,提示HIV的直接作用亦是影响HVEM表达水平的原因之一,Treg细胞HVEM的下降是HIV感染疾病进展的参与因素之一。