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目的：Fis是沙门菌的一个重要调节因子，H:z66阳性伤寒沙门菌在鞭毛H:z66抗体诱导30分钟后，fis基因表达显著上调。本文拟进一步研究伤寒沙门菌Fis对基因表达的系统调节作用。
方法：
(1)伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株制备：采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株，根据伤寒沙门菌fis基因序列设计引物，扩增fis基因上、下游同源性片段，定向连接成fis基因缺损型同源核苷酸片段，并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株，在5％蔗糖LB平板上进行同源重组，通过筛选获得fis基因缺陷变异株；
(2)脉冲场凝胶电泳分析：利用脉冲场凝胶电泳比较fis基因缺陷变异株与伤寒沙门菌野生株的基因组结构差异；
(3)伤寒沙门菌基因表达谱分析：在等渗LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株4h(37℃，250r/min)至对数生长期，收集菌体，分别提取伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株的总RNA，反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5)，与伤寒沙门菌全基因组芯片杂交，扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平，比较伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株基因表达谱的差异；
(4)fis基因缺陷回补株的制备：根据fis基因两端序列设计引物，以伤寒沙门菌基因组为模板，通过PCR扩增获得含fis基因启动子及终止子区域的DNA片段，与表达载体pBAD/gⅢ定向连接后，转化至大肠埃希菌TG1中筛选阳性质粒，经序列分析鉴定后将阳性重组载体及空载体分别转入fis基因缺陷变异株，作为fis基因缺陷回补株和对照株。
(5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析：选择部分表达差异基因，设计并合成特异性引物，进行实时荧光定量PCR，验证DNA芯片分析结果；
(6)动力实验分析：用半固体平板培养观察野生株、fis缺陷变异株和回补株的动力；
(7)fis基因的克隆与表达：根据fis基因两端序列设计引物，以伤寒沙门菌基因组为模板，通过PCR扩增获得不含启动子及终止子区域的fis基因编码区DNA片段，构建表达载体pBAD/Fis，转入大肠埃希菌Top10中，用L-阿拉伯糖诱导fis基因的表达，Ni柱纯化Fis蛋白。
结果：
(1)PCR及序列分析证实，fis基因缺陷变异株中基因159 bp被6 bp取代，表明成功构建fis基因缺陷变异株；
(2)脉冲场凝胶电泳分析结果发现，fis缺失后原存在于野生株的线性质粒缺失；
(3)基因表达谱比较分析结果表明，伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株在对数生长期有25个基因表达上调和69个基因表达下调，主要涉及鞭毛相关蛋白、侵袭相关蛋白、毒力相关蛋白、分泌蛋白、酶类及其它调节因子等；
(4)PCR及序列分析证实，成功构建了重组载体pBAD/fis，已将空载体pBAD/gⅢ和重组载体pBAD/fis导入fis基因缺陷变异株。
(5)对fis基因缺陷变异株中表达差异基因(invF，fliA，dnaC)利用实时荧光定量PCR进行分析其mRNA水平，结果显示其在fis基因缺陷变异株和野生株中表达差异与基因芯片分析结果基本一致，fis基因缺陷回补株和野生株的比较更进一步证实芯片结果的可靠性；
(6)动力实验结果发现fis基因缺陷变异株完全失去动力，fis回补株与野生株比较动力有所恢复；
(7)成功构建了表达载体pBAD/Fis，L-阿拉伯糖诱导Fis蛋白的表达，纯化到Fis蛋白。
结论：
伤寒沙门菌调节因子Fis对鞭毛合成和装配发挥着不可忽视的作用，对细菌的动力，侵袭能力及新陈代谢有显著调节功能，对质粒DNA的复制有重要意义。