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背景：帕金森病(Parkinson’s disease, PD) 是一种常见的中老年神经系统退变性疾病，平均发病年龄为55 岁，70岁人群发病率达120/1万。PD的确切发病机制尚不清楚，目前研究显示其主要病理标志为选择性黑质多巴胺(DA)神经元缺失，残存神经元呈现a-突触核蛋白(α-synucelin, AS)和泛素染色阳性的胞浆内包涵体( Lewy Body, LB)形成,黑质-纹状体通路DA 释放减少，患者出现静止性震颤，肌张力增高，运动减少、随意运动缺失、木僵等一系列症状。Α-突触核蛋白（α-synuclein, SNCA）是第一个被发现的PD 致病基因。Synuclein 是分布于脑内突触前末梢的一组蛋白，被命名为α-synuclein,β-synuclein 和γ-synuclein。它们由113-143 个氨基酸残基组成，参与DA 的神经传递过程和突触内囊泡的转运功能。在这些蛋白中，α-synuclein 与PD 的发病有关。从几个PD 大家系的研究中发现，患者的染色体臂的4q21-23 携有α-synuclein 突变位点，并呈染色体显性遗传。神经变性疾病的病因、临床表现各不相同，但都具有随年龄增长（中年以后）逐渐发生并进展的特征。神经变性疾病的发病机制中，毒性蛋白的错误折叠和异常聚集是其中的关键环节如α-synuclein,SNCA 基因突变（A53T）更容易形成聚集，导致家族性早发PD。研究显示，SNCA 突变或过度表达可加速线粒体功能障碍、增强对氧化应激的敏感性以及DAT 介导的毒性促进细胞死亡。Α-synuclein 是Lewy 小体形成的聚集蛋白。Lewy 小体不仅存在于PD 患者脑内，还存在于多种神经退行性病的神经组织中。
目的：开展对α-synuclein 所介导Lewy 小体病的病理机制研究，以及氧化应激与α-synuclein 之间的关系，对认识和诊断这类疾病具有重要的意义。
方法：①构建及鉴定人野生型及突变型SNCA 基因慢病毒表达载体，并观察在体外大鼠嗜铬细胞瘤细胞中的表达。在引物合成后采用PCR 技术扩增目的基因，并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含 GFP 基因)中，构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCAmu-GFP，通过酶切、测序验证后，将pGC-FU-SNCA-GFP、pGC-FU-SNCAmu-GFP 质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0 共同转染大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12 细胞， 并获得稳定转染。通过噻唑兰比色法（ MTT 法） 检测稳定转染后细胞凋亡水平， 慢病毒pGC-FU-SNCA-GFP(OE)和pGC-FU-SNCAmu-GFP (实验组)(Oem)及不加病毒的空白对照组（CON）和pGC-FU-GFP 空载体对照组（NC）共四组细胞, 病毒转染后不同时间（1d, 2d, 3d, 4d, 5d）细胞增殖情况；碘化丙锭单染法（PI 单染法）检测细胞周期，CON 组、NC 组、OE 组和Oem 组共四组细胞，检测G1 期、G2 期和M期细胞百分比。②利用已建立好的OE 型和Oem 型细胞，测定未转染、转染空质粒、野生型（WT）及突变型（A53T）α-synuclein 的PC12 细胞的活性氧（ROS）水平，以实时定量PCR 法和Western blot 法检测分析经0、50、100 和250 nmol/LH2O2 处理的OE 型和Oem 型细胞α-synuclein 表达。以细胞免疫荧光法和Westernblot 法检测分析经0、50、100 和250 nmol/L H2O2处理的OE 型和Oem 型细胞Lamp-2和LC-3 蛋白的表达。
结果：⑴通过检测标签蛋白绿色荧光蛋白(GFP)和目的蛋白，进一步验证pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCA-GFP 在靶细胞中的表达。通过MTT 法检测稳定转染后细胞凋亡水平，慢病毒pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCAmu-GFP (实验组)及不加病毒的空白对照组和pGC-FU-GFP 空载体对照组共四组细胞, 病毒转染后不同时间（1d, 2d, 3d, 4d, 5d）细胞增殖F 值和P 值分别为4.534 和0.02；196.285 和0.00；411.829 和0.00；1282.049 和0.00；3135.559 和0.00，细胞增殖变缓。PI 单染法检测细胞周期，与空载体组相比，pGC-FU-SNCA-GFP 组和pGC-FU-SNCAmu-GFP (实验组)组G1 期细胞百分比均增多（P=0.00；P=0.00），pGC-FU-SNCAmu-GFP 组较pGC-FU-SNCA-GFP 组G1 期细胞百分比增多更明显（P=0.00）。⑵α-synuclein 转染PC12 细胞后，细胞内ROS 水平增加，按未转染的PC12 细胞、转染空质粒的PC12 细胞、WT 型PC12 细胞、A53T 型 PC12细胞顺序ROS 水平依次增加（P<0.05）；经不同浓度H2O2 处理后，OE 型和Oem 型细胞α-synuclein mRNA 表达水平均无明显改变，OE 型细胞不同浓度组之间无统计学差异（P> 0.05），Oem 型细胞不同浓度组之间无统计学差异（P> 0.05）；在Western blot 检测中，随着H2O2 浓度增加，α-synuclein 表达在OE 型细胞中减少，在Oem 型细胞中增加（均P<0.05）。H2O2处理后，LC3 蛋白的表达在OE型细胞中表达减少，但在Oem 型细胞中表达增强；在Oem 型细胞中，Lamp-2 蛋白的表达在H2O2 处理后减少，而在OE 型细胞表达增加。
结论：α-synuclein 可引起PC12 细胞氧化应激损伤，且不同氧化应激水平对OE 型和Oem 型细胞降解有不同程度的影响。为进一步研究SNCA 基因的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础。