【摘 要】
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干扰素(interferon,IFN)是在特定诱生剂的作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,在同种动物细胞上具有免疫调控和抗病毒活性。内源性IFN-γ水平的高低在很大程度
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干扰素(interferon,IFN)是在特定诱生剂的作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,在同种动物细胞上具有免疫调控和抗病毒活性。内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态。IFN-γ定量分析技术,对免疫学基础研究,以及结核杆菌和布氏杆菌等多种胞内病原感染的诊断,具有高度特异、敏感的突出优势,应用前景广阔。本实验中首先构建了牛IFN-γ受体含信号肽胞外区片段的真核表达质粒,瞬时转染哺乳动物细胞293T细胞,以重组杆状病毒表达牛的IFN-γ为配体,包被ELISA板进行亲和能力检测,结果证明,哺乳动物细胞重组表达牛IFN-γ受体片段表达产物能够分泌到细胞上清中,并与牛的IFN-γ具有良好的亲和反应能力。进一步构建了分别表达牛IFN-γ受体胞外区片段和跨膜-胞内区片段的原核表达质粒,转化宿主菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blotting证实目的蛋白分别获得成功表达。表达的受体蛋白经过Glutathione Sepharose 4B亲和层析获得纯化。在此基础上,利用纯化的重组表达牛IFN-γ受体胞外区片段和跨膜-胞内区片段替代传统的双夹心ELISA技术中的包被抗体(单抗),建立了牛IFN-γ干扰素的双夹心ELISA定量检测方法,并对有关反应条件进行了系统优化。重组受体与其他多种细胞因子反应均为阴性,显示出良好的特异性。使用方法检测大肠杆菌原核表达系统表达的牛IFN-γ,受体胞外区重组蛋白和跨膜-胞内区重组蛋白定量标准曲线的线性回归系数分别为0.9683和0.9722,敏感性可以达到40.65ng/mL;用于检测重组杆状病毒表达牛IFN-γ,受体胞外区重组蛋白和跨膜-胞内区重组蛋白定量标准曲线的线性回归系数分别为0.9656和0.9820,检测的敏感性可达10抗病毒活性单位(IU)/0.1ml。作为对照,美国ADL公司生产的商品化的牛IFN-γELISA检测试剂盒检测重组杆状病毒表达牛IFN-γ,敏感性为80 IU/0.1ml。本研究结果表明,重组表达牛IFN-γ的受体具有良好的特异亲和性,用于替代传统双夹心ELISA技术中的包被抗体(单抗),建立的牛IFN-γ的双夹心ELISA定量检测方法,具有良好的敏感性和特异性方法,与传统抗体(单抗)包被双夹心ELISA相比,具有制备简便、成本低廉的优势。以受体亲和力原理建立的IFN-γ干扰素检测方法,也为其它细胞因子的检测技术开辟了新思路。
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