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研究背景足细胞损伤是大多数肾脏疾病出现蛋白尿的重要病理生理机制。但在这些肾脏疾病中导致足细胞损伤的分子机制仍不完全清楚。钙离子/钙调磷酸酶(CaN)/NFAT2(活化T细胞核因子)/TRPC6信号轴在足细胞骨架损伤和凋亡中起着关键作用;CaN激活可致synaptopodin去磷酸化被降解从而足细胞骨架破坏。转录辅因子Yes相关蛋白(YAP)能结合并调控转录因子,且作为重要的机械力传感器和转导器,具有抗调亡作用。足细胞特异性YAP敲除小鼠可致局灶节段性性肾小球硬化(FSGS)、进展性肾功能衰竭。本研究中我们探讨了 CaN激活和YAP可能在功能上相关的科学假说。研究方法1.体外实验中建立足细胞损伤模型,检测目的蛋白CaN、YAP、CDC42、NFAT2表达及活性改变、synaptopodin表达和细胞骨架变化、足细胞凋亡率及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2表达改变。为了探索CaN对下游目的分子的作用,足细胞分别给予离子霉素(CaN激活剂)、脂多糖及FK506(CaN抑制剂)干预,观察CaN、YAP、CDC42表达及活性、足细胞骨架及细胞凋亡改变。为了探究CDC42在CaN/YAP信号通路中的作用,足细胞分别给予离子霉素及过表达CDC42腺病毒干预,观察CaN、YAP、CDC42表达改变。在体实验建立脂多糖诱导蛋白尿小鼠,给予腹腔注射FK506,检测尿蛋白肌酐比值、血肌酐、足细胞骨架及凋亡改变,足突融合状况。2.进一步探索YAP/CaN信号通路,足细胞分别给予YAP-siRNA、11R-VIVIT(NFAT2 抑制剂)及 SKF96365(TRPC6 抑制剂)干预,观察 YAP、NFAT2、CaN、TRPC6表达变化、细胞活动力及骨架改变、细胞凋亡。在体实验建立足细胞特异性YAP敲除小鼠,给予腹腔注射FK506,检测尿蛋白肌酐比值、血肌酐、观察肾脏系膜基质增生情况、足突融合状况及肾小球基底膜厚度。研究结果1.在不同足细胞损伤体外模型中,CaN表达及活性、核NFAT2表达增加,CDC42表达及活性、核YAP表达减少。体内外研究中,FK506降低脂多糖刺激所致的CaN高表达及活性、上调降低的CDC42和核YAP表达及活性、减轻足细胞骨架破坏及足突融合、抑制足细胞凋亡、明显降低蛋白尿和血肌酐。此外,过表达CDC42可显著抑制离子霉素诱导CaN激活所致的足细胞骨架破坏和凋亡。2.在YAP-siRNA处理体外足细胞中,YAP表达明显减少,CaN、核NFAT2及TRPC6表达均增加。11R-VIVIT或SKF96365均降低沉默YAP所致的CaN、核NFAT2及TRPC6高表达,同时显著抑制足细胞高活动力、骨架破坏及增多的足细胞凋亡。在足细胞特异性YAP敲除小鼠中,FK506显著降低蛋白尿、血肌酐,抑制肾脏系膜基质增生、肾小球基底膜增厚及减轻足突融合。结论CaN/YAP环路介导足细胞骨架破坏、细胞凋亡,蛋白尿发生及肾功能进展,可能是治疗蛋白尿相关肾病的有效靶点。