【摘 要】
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哺乳动物原始卵泡库中的卵泡数量巨大,但仅有极少数的卵泡能够最终发育成熟并排卵,绝大多数卵泡在发育过程的各个阶段均会发生闭锁并最终退化。卵泡闭锁直接影响了哺乳动物繁殖潜力的发挥。然而,目前关于卵泡闭锁的分子机制尚不完全清楚。为了解析猪卵泡闭锁的分子机制,本文利用RNA-seq技术构建了猪健康卵泡和早期闭锁卵泡的转录组表达谱,采用PCR技术扩增了猪卵泡闭锁相关基因DCN编码区序列,采用生物信息学方法分
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（项目编号:31902130）；
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哺乳动物原始卵泡库中的卵泡数量巨大,但仅有极少数的卵泡能够最终发育成熟并排卵,绝大多数卵泡在发育过程的各个阶段均会发生闭锁并最终退化。卵泡闭锁直接影响了哺乳动物繁殖潜力的发挥。然而,目前关于卵泡闭锁的分子机制尚不完全清楚。为了解析猪卵泡闭锁的分子机制,本文利用RNA-seq技术构建了猪健康卵泡和早期闭锁卵泡的转录组表达谱,采用PCR技术扩增了猪卵泡闭锁相关基因DCN编码区序列,采用生物信息学方法分析了猪DCN基因序列特征和蛋白性质,采用RNAi和过表达等技术分析了 DCN在猪卵泡颗粒细胞凋亡中的作用和机制。研究结果对解析猪卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的潜在分子机制具有一定意义。本文的研究结果主要包括以下4个方面:（1）猪健康卵泡和早期闭锁卵泡转录组分析利用RNA-seq技术在猪健康卵泡和早期闭锁卵泡中共鉴定了 1,157个差异表达基因,其中显著上调的基因为660个,显著下调的基因为497个。挑选10个差异表达的基因进行qPCR验证,结果发现与RNA-seq结果高度一致。GO功能富集分析发现差异表达基因富集在212个细胞组分、生物过程和分子功能条目,其中Wnt信号通路、低氧应答、细胞器组分和钙离子结合等条目与卵巢功能和卵泡闭锁有关。KEGG通路富集分析发现差异表达基因显著富集在25个信号通路中,其中TGF-β信号通路和类固醇合成通路等与卵巢功能和卵泡闭锁有关。差异表达基因编码蛋白互作调控网络分析发现15个关键基因,其中TGF-β1、VEGFA和IGF-1等是哺乳动物繁殖力性状的候选基因。这些关键基因和重要信号通路的发现为解析猪卵泡闭锁的分子机制奠定了基础。（2）猪卵泡闭锁候选基因DCN的扩增和生物信息学分析在差异表达基因中选择TGF-β信号通路的DCN基因进行进一步研究。相关分析发现猪卵泡中DCN基因的mRNA水平与卵泡闭锁重要指标P4/E2比值呈现显著正相关（P=0.0144,r=0.4053）,说明DCN是猪卵泡闭锁的候选基因。通过PCR扩增测序获得了猪DCN基因编码区序列,序列全长为1,083 bp,编码蛋白含有360个氨基酸。序列比对发现猪DCN基因编码区序列和编码蛋白氨基酸序列与其他哺乳动物的同源性较高。理化性质分析发现猪DCN蛋白的相对分子质量为39.89 kDa,理论等电点为8.84,是一个理化性质较为稳定碱性蛋白。蛋白二级结构预测发现猪DCN蛋白共含有13个螺旋,9折叠和22无规卷曲等典型的二级结构。结构域分析发现猪DCN蛋白含有1个糖胺聚糖附着位点（GAS）、2个半胱氨酸残基簇、1个富亮氨酸重复序列N端结构域（LRRNT）和多个富亮氨酸重复序列（LRR）。猪DCN基因的扩增、序列特征和蛋白理化性质的解析为研究其功能和作用机制提供了科学依据。（3）DCN是猪卵泡颗粒细胞的促凋亡基因为了分析DCN基因在猪卵泡闭锁中的作用,本文利用小干扰RNA（siRNA）技术敲减体外培养的猪卵泡颗粒细胞中内源性DCN基因的表达,流式细胞技术（FACS）检测发现颗粒细胞凋亡率显著降低。同时,本文构建了猪DCN基因的真核表达载体,并转染猪卵泡颗粒细胞,利用FACS检测发现DCN过表达后猪卵泡颗粒细胞凋亡率显著升高,说明DCN可促进猪卵泡颗粒细胞凋亡。另外,q-PCR发现DCN基因过表达能够显著上调猪卵泡颗粒细胞中促凋亡基因BAX的表达,而抗凋亡基因BCL-2的表达无显著变化。Western blotting发现DCN过表达后细胞凋亡标志蛋白cleaved-Caspase3表达水平显著上调。上述结果证实DCN基因是猪卵泡颗粒细胞中的促凋亡基因。（4）DCN是猪卵泡颗粒细胞中TGF-β信号通路的抑制因子前人研究证实DCN是TGF-β信号通路的抑制因子。为了分析DCN对猪卵泡颗粒细胞中TGF-β信号通路的影响,本文采用Western blotting技术分析了敲减和过表达DCN后猪卵泡颗粒细胞中TGF-β信号通路活性标志蛋白-磷酸化SMAD3（P-SMAD3）蛋白水平。结果发现,敲减DCN后猪卵泡颗粒细胞中总SMAD3（T-SMAD3）蛋白水平无显著变化,而P-SMAD3蛋白表达水平显著升高。相反的,DCN过表达后猪卵泡颗粒细胞中T-SMAD3蛋白水平无显著变化,而P-SMAD3蛋白表达水平显著降低,表明DCN作为负调控因子抑制猪卵泡颗粒细胞中TGF-β信号通路的活性。综上所述,本文构建了猪健康卵泡和早期闭锁卵泡的转录组表达谱,鉴定了多个猪卵泡闭锁的关键基因和重要信号通路;扩增了猪卵泡闭锁相关基因DCN的编码区序列,发现DCN是猪卵泡颗粒细胞的促凋亡基因和TGF-β信号通路的抑制因子。研究结果为解析猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的分子机制奠定了基础,提高母猪繁殖力提供了潜在的靶点。
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