论文部分内容阅读
牙鲆(Paralichthysolivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型。甲状腺激素(Thyroid Hormone,TH)在牙鲆变态发育过程中发挥着决定性作用。甲状腺激素的生理作用主要是通过甲状腺激素受体(Thyroid Hormone Receptors,TRs)发挥,TRs有TRα和TRβ两种亚型。TR通过结合甲状腺激素反应元件(TRE)的特异性DNA序列—AGGT(C/A)A来调节靶基因的转录。为找出TH直接调控的靶基因,本研究以甲状腺激素受体TRαA、TRβ为对象,在HEK293T细胞中表达并纯化了牙鲆p3×Flag-TRαA和p3×Flag-TRβ融合蛋白,采用一种目的基因循环扩增与筛选(CAST,Cyclic Amplification and Selection of Target)的方法,得到一些与融合蛋白结合的特异性序列,对比牙鲆基因组后并用双荧光素酶报告实验和荧光定量PCR实验鉴定出TH调控的靶基因。主要结果如下:1.牙鲆TRαA、TRβ真核表达载体构建及融合蛋白表达纯化取实验室已有的p3×Flag-TRαA和p3×Flag-TRβ重组真核表达载体,TA克隆验证TRαA、TRβ基因准确无误后取重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,取含有细胞总蛋白的裂解液通过G1亲和层析柱纯化,BCA法检测纯化后融合蛋白质浓度进行Western Blot检测,结果显示牙鲆TRαA、TRβ在哺乳动物蛋白表达系统中成功表达。2.牙鲆甲状腺激素调控的靶基因的筛选首先分别合成两条两端为特异扩增引物、中间随机的互补单链随机序,退火合成双链随机识别文库。利用DNA-蛋白质互相作用特性,将合成的DNA双链识别随机文库通过DNA-蛋白质结合体系分别与p3×Flag-TRαA、p3×Flag-TRβ融合蛋白互相作用,经过六轮的目的基因循环扩增与筛选(CAST)后,最后一轮扩增产物TA克隆得到TRαA识别序列63个,TRβ识别序列59个。3.候选靶基因的分析与预测TRαA识别文库中有12个含有TRE序列的特异性识别序列;TRβ识别文库中有13个含有TRE序列的特异性识别序列;TRαA和TRβ识别文库中存在部分重合的特异性识别序列。然后将识别序列利用生物信息学方法比对牙鲆基因组启动子区域筛选出启动子区域能匹配文库识别序列且含有TRE序列的候选靶基因。TRαA识别文库筛选得到12个符合要求的候选靶基因;TRβ识别文库筛选得到13个符合要求的候选靶基因。通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库比对候选靶基因的CDS区,TRαA识别文库选得到11个有效的候选靶基因;TRβ识别文库筛选得到的12个有效的候选靶。其中TRαA与TRβ识别文库4个识别序列含有部分重合序列或是序列不同却对应同一基因不同TRE位点,因此筛选得到4个相同的候选靶基因:frizzled-3-like、TBC1 domain containing kinase(tbck)、aminoacyl t RNA synthetase complex interacting multifunctional protein 1(aimp1)和MYC associated factor X(max)。TRαA识别文库筛选得到的剩余7个靶基因分别是:mannose binding 2(lman2)、RAB GTPase activating protein 1(rabgap1)、apoptosis-enhancing nuclease-like、F-box and WD repeat domain containing 8(fbxw8)、FAST kinase domain-containing protein 3 mitochondrial-like、tousled like kinase 2(tlk2)和family with sequence similarity 198 member A(fam198a)。TRβ识别文库筛选得到的剩余8个靶基因分别是:dual specificity protein phosphatase 7-like(dusp7)、serine/threonine-protein kinase 26-like(stk26)、syntaphilin-like、A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 10-like(admats-10)、MAP kinase activating death domain(madd)、teratocarcinoma-derived growth factor-like(tdgf)、phosphodiesterase 4D(pde4d)和pleckstrin homology domain-containing family A member 5-like。4.候选靶基因在牙鲆成鱼组织中的表达选取5个TRαA靶基因、4个TRβ靶基因、4个TRαA与TRβ共同作用靶基因,利用实时荧光定量PCR检测各个基因在牙鲆成鱼脑、肌肉、心脏、鳃、肾脏、胃、肠和肝脏组织中的表达情况。结果显示除pde4d与dusp7在脑组织中表达并不显著(P>0.05),其他基因在脑组织中表达均十分显著(P<0.05)。除此之外,TRαA候选靶基因还在心脏组织、肾组织中表达显著(P<0.05),TRβ候选靶基因还在心脏组织、鳃组织中表达显著(P<0.05),TRαA与TRβ共同候选靶基因仅在脑组织中表达显著(P<0.05)。5.候选靶基因在牙鲆仔鱼变态时期的表达利用实时荧光定量PCR检测各个基因在牙鲆仔鱼变态发育17 dph、20dph、24dph、28dph、32dph以及36dph的表达情况。结果显示所有的靶基因大致分为两类:一类17-20 dph表达量逐渐升高,28 dph表达量达到峰值,32-36 dph表达量逐渐降低,初步推断此类靶基因的表达受到TH的促进作用;一类17 dph表达量最高,20-28 dph表达量逐渐降低,28 dph表达量降到最低值,32-36 dph表达量又逐渐升高,初步推断此类靶基因的表达则是受到TH的抑制作用。总之这两类基因均受TH的调控。6.外源性TH和TU对候选基因牙鲆变态发育期的表达影响为验证候选靶基因是否确实受到TH的调控作用,设置使用外源性TH和TU(Thiourea,TU抑制仔鱼的变态进程)处理未变态的牙鲆仔鱼以及无处理未变态的牙鲆仔鱼(NC)3组,对各组各个基因在仔鱼不同变态发育时期的表达量进行了比较研究。结果显示,前面初步推断受到TH的促进的靶基因,28 dph的TH组表达量相较于NC组基本无差异(P>0.05),且在与TU比较表达量最为显著(P<0.05),而TH组相较于NC组在17 dph、20dph或36 dph时表达量会有显著升高,各时期TU组的表达量均会低于NC组和TH组;前面初步推断受到TH抑制表达的候选靶基因,不论是NC组、TH组还是TU组,多在28 dph表达量最低的(P<0.05),而NC组相较于TH组在17 dph、20dph或24 dph时表达量会有显著升高(P<0.05),各时期TU组的表达量均会略高于TH组(P>0.05)。7.候选靶基因启动子转录活性验证为了进一步验证筛选出来的候选靶基因是否确实受到TH的调控,本章实验中选取2个TRαA候选靶基因(fbxw8、apoptosis-enhancing nuclease-like)、3个TRβ候选靶基因(dusp7、pleckstrin homology domain-containing family A member 5-like与admats-10)、2个TRαA与TRβ共同候选靶基因(frizzled-3-like、max),克隆其启动子区域含有TRE位点的片段,构建报告基因重组质粒,转染HEK293T,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒验证各个候选靶基因启动子转录活性。实验结果不但验证选取的靶基因启动子转录活性确实受到TH受到的调控,还发现启动子区域越多的TRE位点,受到TH的调节作用越显著。此外还发现能够同时结合TRαA与TRβ相比单一结合TRαA或TRβ,TH的调节作用越显著(P<0.05)。结论:本实验利用TH直接调控的靶基因含有TRE序列—AGGT(C/A)A的特性和DNA-蛋白质互相作用的技术方法,筛选出TRαA的候选靶基因11个,TRβ的候选靶基因12个,其中TRαA和TRβ存在4个相同的候选靶基因,并通过实时荧光定量PCR和双荧光素酶报告实验验证这些基因确实受到TH的调控,属于TH调控的靶基因,补充了TH调控牙鲆变态的发育网络的基础性资料。该方法是本实验室结合之前相关DNA-蛋白鉴定方法的基础上,又进一步改良后获得的一种鉴定蛋白质作用于DNA的有效方法,为今后的蛋白质-DNA互作研究提供了一种有效的方法。