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胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)主要由肝脏合成和分泌,与肝功能密切相关,具有减轻肝脏氧化损伤、降低肝纤维化、改善肝功能的作用。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是已知的最强促肝纤维化因子,通过TGF-β1/Smads途径抑制肝细胞生长、激活肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC),是一个重要的纤维化治疗靶标,应用其Ⅱ型受体胞外域(extracellular transforming growth factorβreceptor II,eTGFBR2),能拮抗TGF-β1活性,发挥治疗肝纤维化作用。小分子蛋白药物(小于20 kD)在体内代谢过程中易被肾小球过滤或被蛋白酶降解,具有较短的循环半衰期,临床使用时必须高频或大剂量给药才能获得一定疗效。为提高小分子蛋白稳定性,本研究应用人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合技术,构建HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2融合蛋白并在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中稳定表达,经分离纯化获得了具生物活性的融合蛋白。对两种融合蛋白进行体外、体内抗纤维化活性评价,探究其抑制肝纤维化进程与改善肝脏功能的作用。主要结果如下:(1)应用HSA融合技术获得hsa-igf-1融合片段,插入真核高效表达载体pMH3中,构建重组表达载体pMH3-HSA-IGF-1并电转染至CHO细胞中,经G418压力筛选及单克隆挑选,获得HSA-IGF-1稳定表达细胞株。对表达量最高的细胞株进行3 L摇瓶补料流加培养,经8天流加培养,细胞密度最高达8.4×106 cells·m L-1,HSA-IGF-1的最终表达量达100 mg·L-1。经Blue柱、Octyl柱和Q柱三步纯化,获得纯度约94%的HSA-IGF-1融合蛋白,整个过程总回收率约为31.5%。分离纯化的HSA-IGF-1具有类似IGF-1的生物活性,通过激活PI3K/AKT信号通路,促进NIH3T3细胞增殖。(2)应用HSA融合技术获得hsa-etgfbr2融合片段,构建重组表达载体pMH3-HSA-eTGFBR2并电转染至CHO细胞中,经G418压力筛选及单克隆挑选,获得HSA-eTGFBR2稳定表达细胞株。对表达量最高的细胞株进行3 L摇瓶流加培养,细胞密度最高达8.5×106 cells·mL-1,HSA-eTGFBR2流加培养8天的最终表达量为180 mg·L-1。经Blue柱、Octyl柱和Q柱纯化,获得纯度约91%的融合蛋白,总回收率约为36.8%。HSA-eTGFBR2与TGF-β1结合良好,两者亲和常数KD值为1.42×10-8 mol·L-1,HSA-eTGFBR2能拮抗TGF-β1的抑制肝细胞增殖作用。(3)对HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2进行体外抗肝纤维化活性测定。HSA-IGF-1可以解除TGF-β1对肝细胞增殖及周期的抑制作用,保护肝细胞免受TGF-β1损伤。HSA-eTGFBR2能结合TGF-β1,拮抗其促HSC细胞增殖效果。应用TGF-β1诱导的活化HSC-T6细胞作为体外肝纤维化模型,HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2能明显降低胞内α-SMA、COLⅠ、TIMP-1及上清中COLⅠ和COLⅢ的表达水平,提高MMP-2的水平,抑制HSC-T6细胞的活化及ECM的积累。初步探讨其机制,两种融合蛋白皆能降低TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化,从而抑制TGF-β1信号转导,抑制TGF-β1的生物功能,发挥抗肝纤维化效果。(4)HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2的体内抗肝纤维化分析。CCl4能引起肝脏结构紊乱、肝细胞坏死、胶原纤维增生,损伤肝功能,诱导纤维化。HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2均能明显改善肝纤维化症状,减轻肝细胞损伤及胶原沉积,改善肝功能,降低肝脏中纤维化标志物α-SMA和COLⅠ的表达水平,而白蛋白几乎没有治疗效果。结果还显示,干预治疗组优于造模后再治疗组,提示肝纤维化程度较低的时候治疗效果较好。HSA-IGF-1和HSA-eTGFBR2两种融合蛋白均在一个低注射频率下取得较好治疗作用,显示了两种蛋白良好的抗肝纤维化效果。