毛酸浆A和C类MADS-box同源基因功能进化研究

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形态创新(morphological novelties)的起源和调控机制是进化发育生物学研究的热点之一。茄科酸浆属(Physalis)植物的“中国灯笼”或膨大花萼症状(ICS,inflated calyx syndrome)是一个全新的花后形态结构。本论文以毛酸浆(Physalisfloridana)为试材,通过反向遗传学策略揭示转录因子MADS-box基因在花器官的身份决定、浆果膨大和“中国灯笼”进化发育中的功能分化和作用机理,探讨植物花与果实发育调控网络在进化中的保守性与多样性。主要结果与结论如下:  (1) MPF3和MPF2调控花萼身份、“中国灯笼”大小和雄性育性  “中国灯笼”的起源和发育与MADS-box基因MPF2(MADS-box gene2 fromP.floridana)在花器官中的异位表达密切相关。本研究表明毛酸浆基因组中有四个APETALA1(AP1)同源基因(A类MADS-box基因),其中MPF3(MADS-boxgene3from P.floridana)是番茄LeMADS-MC的直系同源基因。LeMADS-MC调控番茄花萼的身份和果萼的大小。MPF3与MPF2和一些花部器官特异表达的MADS-domain蛋白(如C-功能)互作,选择性地结合于MPF2启动子的CArG-box(CC-A-rich-GG)上,调控MPF2在花部器官中的表达。当MPF3单独显著下调后,花萼增大并叶化,但“中国灯笼”变小,花粉中的淀粉积累受阻,MPF2的表达在花萼和雄蕊中显著升高;当MPF2单基因显著下调后,花萼身份不变,“中国灯笼”也变小,花粉成熟严重受阻,MPF3的表达则不受影响;当MPF2和MPF3的表达被同时下调后,可以产生形态正常或轻微叶化的花萼和变小的“中国灯笼”,成熟花粉的比例明显提高,但仍有约30%的花粉不能成熟。所以,MPF3通过与MPF2的物理互作以及与MPF2的遗传互作(抑制)来决定花萼身份和大小,调控ICS形成和雄性育性。同时发现敲除MPF3后,毛酸浆PFINV4(P.floridana invertase gene4)受到明显抑制,该基因的直系同源基因在水稻等植物中编码糖分解转运途径中的关键酶。我们用VIGS(virus-induced genesilencing)技术敲除PFINV4引起花粉成熟度显著性降低。  (2) C-类MADS-box同源基因的功能分化样式  MPF2与C类MADS-domain蛋白的互作很可能参与调控雄性育性。本研究发现毛酸浆基因组中存在三个C类MADS-box同源基因,分别命名为PFAG1(P.floridana AGAMOUS1)、PFAGL1(P.floridana AGAMOUS-LIKE1)和PFAG2(P.floridana AGAMOUS2)。PFAG1和PFAGL1主要在花的生殖器官,尤其是心皮中高表达,而PFAG2主要在花的营养器官如萼片以及果实中高表达。蛋白亚细胞定位分析表明PFAG1主要定位于细胞核,而PFAG2和PFAGL1在核质中均有定位。进一步利用VIGS技术对毛酸浆三个C类MADS-box基因进行不同组合的敲除,发现它们的功能发生了明显分化:PFAG1、PFAG2和PFAGL1均与雄蕊和雌蕊的身份决定相关,PFAG2和PFAGL1参与浆果发育,PFAGL1影响雌性育性。此外,PFAG1和PFAGL1能够促进PFINV4的表达,三个C类蛋白抑制PfCYCD2;1(P.floridana CyclinD2;1)的表达。  (3)已分离的MADS-box基因的蛋白互作模式  利用BiFC(bimolecular fluorescence complementation)手段对所有已知的毛酸浆MADS-domain蛋白之间的相互作用在植物体内进行了分析,并发现A类蛋白MPF3可以与MPF2和C类等蛋白互作;而C类蛋白的互作模式与其它被子植物的相似,同时发现PFAG1和PFAGL1能够分别形成同源二聚体并相互形成异源二聚体。  以上研究结果进一步完善了酸浆属“中国灯笼”进化发育的分子机制,并为理解被子植物中A和C类MADS-box基因重复及其功能进化提供了新证据。
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