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研究目的1.利用基因芯片技术,检测荷瘤TA2小鼠自发性乳腺癌组织及其未发瘤乳腺组织基因组表达状态,筛选两种组织间的差异表达基因,初步确定与TA2小鼠乳腺癌发生相关的侯选基因,并进一步探讨部分基因的异常表达与TA2小鼠乳腺癌发生的关系,为阐明人乳腺癌,尤其是家族性乳腺癌的发生机制提供一定的理论依据。2.初步探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR4、整合素α4、αL及β2、L-选择素的表达与TA2小鼠乳腺癌多器官转移的关系,为临床评估乳腺癌转移潜能和发现抑制肿瘤转移的治疗靶点提供理论依据。研究方法1.利用Affymetrix Mouse Genome 430 2.0基因表达谱芯片检测乳腺癌荷瘤TA2小鼠的肿瘤组织及其未发瘤乳腺组织的基因组表达情况,选用MAS5.0、Array2BIO及BGX三种软件分别筛选这两种组织间的差异表达基因。通过比较三种软件筛选基因的异同,确定应用单一软件分析筛选差异表达基因时的适当标准。利用PubMed数据库及Gene Ontology基因注释初步确定三种方法共同筛选出的差异表达基因与肿瘤发生、发展的关系。2.选取三种方法共同筛选出的与肿瘤发生有关的部分基因进行后续验证。本研究选择了印迹基因DCN、癌基因EGFR和Cyclin D1。利用Real-time PCR和免疫组织化学方法分别从mRNA和蛋白水平检测5-6月龄TA2小鼠正常乳腺组织(A组)、乳腺癌荷瘤TA2小鼠未发瘤乳腺组织(B组)及肿瘤组织(C组)中上述三个基因的表达情况。3.收集本研究室保存的高转移性(可发生多器官转移,A组)、低转移性(无远处转移或仅发生肺转移,B组)TA2小鼠乳腺癌及A组肺、肝和脾转移瘤标本,利用免疫组化方法检测原发瘤及转移瘤组织中CXCR4、SDF-1、L-选择素及整合素α4、αL和β2的表达情况,利用Real-time PCR检测不同转移能力的原发瘤组织中这些分子的mRNA相对表达水平。结果1.基因芯片检测结果1)MAS5.0分析软件筛选出了3416个差异表达基因(P<0.0025),其中1681个基因在肿瘤组织中表达上调；Array2BIO分析软件筛选出了661个差异表达基因(P<0.01),其中217个基因在肿瘤组织中表达上调；BGX分析软件筛选出了2456个差异表达基因,其中1104个基因表达上调,这2456个基因的差异表达分布图包括Ⅰ型分布图420个、Ⅱ型分布图646个、Ⅲ型分布图1390个,Rank介于24.01～385.02,三种类型分布图的Rank上限在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分布图间依次降低。2) MAS5.0、Array2BIO和BGX三种软件共同筛选出的基因有260个,分别占各自筛选的基因总数的7.61%、39.33%和10.59%。Array2BIO和MAS5.0分析时以P<0.00015为标准,两种软件可分别筛选出94.23%和95.00%的三种软件共有基因,而候选基因数目分别减少了10.59%和21.60%。BGX分析结果显示：BGX分布图包括Ⅰ型分布图170个,Ⅱ型分布图74个,Ⅲ型分布图16个,分布图的构成比与BGX单独分析时明显不同(χ2=368.29,P<0.0001),主要为Ⅰ型和Ⅱ型分布图,选取具有Ⅰ型和Ⅱ型分布图的基因可使候选基因数目减少56.60%。这260个共有基因中,60.38%的异常表达与多种肿瘤的发生、发展、转移、预后或治疗有关,其中与人乳腺癌或小鼠乳腺肿瘤有关的基因有68个。2. DCN、EGFR、Cyclin D1及PCNA在正常乳腺及乳腺癌组织中的表达1)免疫组化染色结果显示：DCN高表达率在A组(50%)显著高于B组(17.86%)(P<0.05)；B组EGFR高表达率和核阳性表达率均显著高于A组(χ2=7.56,20.49；P<0.01),并且高表达率显著高于C组(χ2=4.38；P<0.05)；B组和C组中Cyclin D1标记指数在EGFR核阳性表达者均显著高于核阴性表达者(Z=-2.28,-2.07,P<0.05),两组EGFR核阳性表达水平均与Cyclin D1标记指数呈显著正相关(rs=0.723,0.474,P<0.05), PCNA的表达与EGFR是否存在核表达无关。2) Real-time PCR结果显示：DCN mRNA相对表达水平在A组最高(0.95±0.25),在C组最低(0.13±0.10),A、B、C三组间呈递减趋势(P<0.05)；EGFR mRNA相对表达水平在B组最高(0.05±0.02),在A组最低(0.02±0.01),B组显著高于A组和C组(P<0.05); Cyclin D1 mRNA相对表达水平在C组最高(0.42±0.22),在A组最低(0.04±0.01),A、B、C三组间呈递增趋势(P<0.001)；PCNA在B组表达水平最高(0.38±0.24),在A组最低(0.14±0.10),B组显著高于A组和C组(P<0.05)。3.高转移性TA2小鼠乳腺癌的特征本研究室收集的7例高转移性乳腺癌的高转移特性存在差异,部分肿瘤在体内传代时逐渐丧失高转移能力。具有稳定的高转移特性的肿瘤乳腺原位接种时移植瘤生长缓慢,接种瘤细胞后3w即可在肺及脾出现肉眼明显可见的转移瘤,而肝镜下可见多发微转移瘤。7例原发瘤及其转移瘤中均观察到了血管生成拟态,血管生成拟态的阳性率明显高于低转移性乳腺癌(P<0.05)。4. CXCR4、CXCL12、L-选择素及整合素4、αL和β2在高转移性(A组)和低转移性(B组)TA2小鼠乳腺癌及A组肺、肝和脾转移灶中的表达1)免疫组化结果显示：A组和B组原发肿瘤组织中CXCL12、L-选择素、整合素αL的平均阳性细胞百分比分别约55.49% VS.33.13%、39.81% VS.16.75%、24.81% VS.10.47%,三种分子在A组中的表达均显著高于B组(Z=-2.41,-2.14,-2.31；P<0.05),而CXCR4、整合素α4和β2的表达在A组与B组间无明显差别；转移瘤与原发瘤相比仅L-选择素的平均阳性细胞百分比在肝转移灶中显著高于原发瘤(Z=-2.24,P=0.025),而CXCR4、CXCL12、整合素α4、αL、β2平均阳性细胞百分比在转移瘤与原发瘤间差别均无统计学意义,并且整合素αL和CXCR4在部分转移灶中呈阴性表达。2) Real-time PCR结果显示：原发肿瘤组织L-选择素、整合素αL mRNA相对表达水平在A组显著高于B组(Z=-3.32,-3.47,P=0.001),而整合素α4和β2mRNA相对表达水平在两组间无明显差异。结论1.多种软件联合分析或单一软件分析Affymetrix基因表达谱芯片时采用不同的判定标准均可显著缩小侯选基因的范围,可以提高后续验证的准确性,尽管此方法有可能丢失部分与肿瘤发生有关的基因。2.TA2小鼠乳腺组织中DCN表达水平随鼠龄增长逐渐降低,而EGFR表达却逐渐升高,并且出现了核表达。核表达的EGFR可通过上调Cyclin D1的表达使部分上皮细胞呈现高增殖能力。乳腺组织中DCN、EGFR、Cyclin D1的异常表达是中老年TA2小鼠乳腺上皮细胞具有高增殖活性的原因之一,可能与其乳腺癌发生有关。3.TA2小鼠乳腺癌细胞的高转移能力并不稳定,存在减退现象。趋化因子及其受体(CXCL12/CXCR4)、淋巴细胞归巢有关分子(L-选择素、整合素α4、αL和β2)中仅L-选择素的表达可能与其肝转移有关,这些分子的表达并不是高转移性TA2小鼠乳腺癌多器官转移的主要原因。乳腺癌细胞可表达白细胞或淋巴细胞所特有的整合素或选择素分子,其转移可能与细胞融合有关。高转移性自发瘤原发瘤及其转移瘤中均存在血管生成拟态,较强的促血管生成拟态形成能力可能是其转移瘤生长较快的原因之一。