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结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种常见的恶性肿瘤,全球范围内,男性和女性的发病率分别排在所有恶性肿瘤的第三位和第二位。结肠癌的发生受到饮食、生活习惯、遗传等诸多因素的影响,其发病过程涉及多个信号通路。Ras、c-fos、EGFR、TP53、β-catenin等基因都与结肠癌的发生密切相关。炎症反应贯穿结直肠癌发生发展的整个过程,对肿瘤的起始、恶化、迁移都发挥重要作用。免疫细胞、炎症因子以及肠道菌群的紊乱都有可能在结直肠癌的发生、发展和转移中发挥作用干扰素-γ(Interferon-γ IFN-γ)作为一种重要的炎症因子,主要由免疫系统中的T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)分泌产生,IFN-γ在机体的自身免疫调节、获得性免疫调节、炎症反应、造血以及细胞的增殖、凋亡、衰老等多种生理过程中也发挥重要作用。IFN-γ与肿瘤发生发展的关系也非常密切。已经发现IFN-γ对肺癌、卵巢癌、肝癌等多种肿瘤均具有明显的抑制作用。IFN-γ受体Ifngr1或者其下游关键因子Star1缺失的小鼠中,更容易发生肿瘤。例如,在化学致癌剂甲基胆蒽(Methy1-cholanthrene, MCA)作用下,Ifngr1或者Stat1缺失的小鼠更容易诱发肿瘤。但是,IFN-γ在肿瘤中的作用具有双面性。某些情况下,IFN-γ可以发挥促瘤作用。紫外线诱导的黑色素瘤的发生依赖于IFN-γ信号通路,IFN-γ信号缺失的小鼠可以抵抗紫外线诱导的黑色素瘤形成。有研究小组发现,在小鼠胃部特异性过表达IFN-γ,可以造成小鼠胃部假性肥大同时诱导了胃部肿瘤的发生。IFN-γ在结直肠肿瘤的发生发展中也发挥重要作用。IFN-γ信号通路的关键因子IFNGR1、IFNGR2、IRF1、IRF2的突变均发现与人类结肠癌的发生相关联。体外实验发现IFN-γ对结肠癌细胞的生长有抑制作用。IFN-γ可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达,增加结肠癌细胞对TARIL的敏感性。IFN-γ与TNF-α联合使用还可以抑制小鼠体内接种的结肠癌细胞生长。这些结果提示IFN-γ可能对结肠癌发挥抑制作用。另一方面,敲除炎症抑制因子Socs1基因的小鼠会自发产生肠道肿瘤,其肿瘤的发生依赖于IFN-γ。另外,IFN-γ可以促进肠道炎症反应,硫酸葡聚糖(Dextran sodium sulfate, DSS)诱导的小鼠肠炎反应就依赖于IFN-γ。而肠道炎症会增加肠道肿瘤的发生几率。由此推断,IFN-γ对肠道肿瘤也发挥促瘤作用。IFN-γ信号通路在肿瘤发生发展中的作用错综复杂,它在结直肠癌症的发生发展中到底发挥怎样的作用?促瘤还是抑瘤?其作用的具体机制是什么?目前并没有比较明确的答案。为了探讨IFN-γ信号通路在结直肠癌发生发展中的作用,本研究论文利用ApcMin/+小鼠为模型,对IFN-γ信号通路在肠道肿瘤发生发展中的作用及调控机制进行了探讨。第一部分IFN-γ受体缺失促进ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发生发展ApcMin/+小鼠对于研究结直肠癌症的发病机制和治疗方法具有非常重要的应用价值。炎症反应在ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。研究发现,Cox2、MyD88、Gstp、IL6、Stat3、Gas6等炎症相关基因在ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生发展中均发挥一定的作用。利用ApcMin/+雄性小鼠与Ifngri*雌性小鼠交配,获得Ifngr1+/-ApcMin/+小鼠。再用Ifngr1+/-ApcMin/+与Ifngr1+/-Apc+/+小鼠交配,获得Ifngr1+/+ApcMin/+和Ifngr1v-ApcMin/+我们发现,与Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠相比,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的生存期明显缩短,贫血更为严重,脾脏代偿性增大更为显著。对小鼠肠道肿瘤进行计数发现,与lfngr1+/+ApcMM*小鼠相比,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠结肠和小肠中的肿瘤数目均有明显增多(P<0.01),肿瘤的尺寸也更大(P<0.01)。利用Ki67免疫染色发现Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤细胞的增殖速度更快。同时Pcna的表达水平更高。Tunel染色发现Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠与Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤和正常组织细胞凋亡没有明显的差别。C57BL6背景下的ApcMin/+小鼠肠道肿瘤一般为良性腺瘤,几乎没有肿瘤会发生恶变。对小鼠肠道肿瘤进行组织学分析发现,Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠肠道肿瘤均为良性肿瘤,而Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的肠道肿瘤发生严重的结构紊乱。形态学特征显示,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中30-40%发生了侵袭。为了从基因表达水平更全面的评价Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的特点,及其增多和恶化的分子机制,利用RNA-seq技术对Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠和Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的肠道肿瘤组织进行了表达谱分析,对RNA-Seq结果进行分析,发现在Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠和Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的肠道肿瘤中共有4021的基因表达水平发生显著改变(p<0.05)。KEGG数据库聚类分析发现,炎症反应、细胞增殖等多个发挥促瘤作用的信号通路在Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的肠道肿瘤发生明显的表达上调,而三羧酸循环、氧化磷酸化等产能相关信号通路在Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的肠道肿瘤中表达下调。利用qRT-PCR验证了Mmp3、 Mmp7、Mmp9、Hif1α、Lrg1、Cdhr2、Cdx2等基因表达的改变。免疫组化方法验证了小鼠肠道肿瘤中MMP3和CD31 (Pecam-1)的表达情况。结果发现,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中MMP3表达增多、新生血管增多。肿瘤组织中基因表达谱和免疫组化结果进一步证明Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发生发展加剧,肿瘤的恶性程度增加。我们同时对Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠和Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的肠道正常组织和肿瘤组织中的差异表达基因进行RNA-seq检测和分析。并将两种小鼠肿瘤中表达上调的基因与人类结肠癌病人肿瘤组织中的上调基因(GSE20842)进行比较。结果发现,Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中表达上调基因更多的与人类结肠癌病人肿瘤中上调基因重叠,说明Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的基因表达模式更接近人类结肠癌恶性肿瘤的基因表达模式。此结果一方面进一步证明Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤为恶性肿瘤,同时提示Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肠道肿瘤的特点和发生机制更接近人类结肠癌,是比单纯的ApcMin/+小鼠更好的人类结肠癌动物模型。第二部分Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道炎症反应加剧ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生虽然不依赖于肠道炎症,但炎症反应在其肿瘤的发生和发展过程中会发挥重要的促进作用。细菌感染和DSS处理都可以促进ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生发展。某些具有抗炎作用的化合物,例如小檗碱则对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤有抑制作用。Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤增多的同时,肿瘤微环境的炎症反应发生怎样的变化?我们发现,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中,Cxcl2、Cxcl5、Saa3、 Tnf-a、IL-1β、Cox2等炎症因子的表达上调,而抑制炎症反应的Cd74表达水平则有明显的下调。说明,相比Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤炎症反应更加严重。巨噬细胞与多种肿瘤发生有关,巨噬细胞浸润到肿瘤细胞周围,称为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAM)-TAM可以促进肿瘤生长。但是TAM的功能具有可塑性,在IFN-γ等Thl细胞因子的刺激下,TAM主要向着具有抗肿瘤作用的M1型极化；而在IL-4, IL-10等Th2细胞因子的刺激下,TAM就会向M2型极化,M2型的TAM则促进肿瘤细胞的增殖。F4/80免疫组化染色发现,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中浸润更多的巨噬细胞。利用qRT-PCR对小鼠肠道中部分炎症因子的表达水平进行检测。结果发现,M1型TAM的标志性炎症因子Cxcl9在Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中的表达水平有所降低；而M2型TAM的标志性炎症因子Arginasel、Trem2和Yml在的表达水平却明显上调。说明Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道TAM向着具有促瘤作用的M2型极化。巨噬细胞的极化与CD4+T细胞相关,CD4+T细胞的活化和分化状态对肿瘤的发生发展也发挥重要作用。CD4+T细胞有Th1、Th2和Th17等细胞亚群,Th1具有抑制肿瘤的作用,而Th2和Th17有促进肿瘤发生和发展的作用IFN-γ可以通过调节T细胞极化影响肿瘤发展。我们首先利用免疫荧光方法检测了小鼠肠道肿瘤中CD4+细胞的分布情况。发现,Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠和Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中,CD4+细胞的分布没有显著的差异。Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的Ifngr1缺失导致IFN-γ信号通路缺陷,其Th1细胞功能损坏。IL-4诱导Th2极化,同时也是Th2细胞的分泌因子和主要效应分子,其表达水平在的Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠和Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠间没有差别。IL-23a和IL-17a是Th17细胞的诱导分子和效应分子,二者的表达在Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中均有显著的上调。IL-23a和IL-17a的表达上调进一步表明Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤炎症反应加剧,其肿瘤相关炎症反应向着具有促瘤作用的方向发展。杂合性丢失(Loss of heterozygosity, LOH)导致的野生型Apc基因丢失是C57BL/6J背景下ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发生的起始步骤和原因。而严重的慢性炎症本身也可以诱发肿瘤。我们分离Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠的肠道肿瘤,并对Apc基因位点进行了LOH检测。结果发现在所有被检测的Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肿瘤中,Apc基因位点均发生了LOHo Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生与Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠一样,也是依赖于Apc基因位点的LOH。第三部分IFN-y通过上调Dkk1的表达抑制β-catenin活性β-catenin的激活是是ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发生的典型特征,在肿瘤的发生、发展和恶化过程中都发挥重要作用。β-catenin进入细胞核,与TCF一起激活c-MyCs CyclinDI等下游靶基因,促进肿瘤细胞的发生发展。β-catenin的活性随着肿瘤的发展而持续激活,β-catenin的水平也与结肠肿瘤的大小成正相关β-catenin的过度激活对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生发展有促进作用。Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤增多和恶化的同时,P-catenin的活性发生怎样的变化?Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤增多是否与β-catenin调控的改变有关?免疫组化染色发现,与Ifngr1+/+ApcMin/+小鼠相比,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中β-catenin的表达水平更高,其细胞核聚集也更加明显。利用qRT-PCR对小鼠肿瘤中β-catenin靶基因c-Myc和CyclinD1的表达水平进行检测,发现Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中β-catenin靶基因的表达水平明显上调。Ifngri缺陷导致β-catenin活性进一步升高。ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中β-catenin的激活是由Apc基因的突变或LOH造成的,但是其他因素可以使β-catenin的激活进一步加剧。Wnt配体的拮抗因子对β-catenin的调控起着重要作用。DKK1是重要的Wnt配体拮抗因子,对β-catenin信号通路有抑制作用。正常肠上皮细胞以及肝癌细胞中均发现IFN-γ可以通过上调Dkk1的表达影响β-catenin的活性。Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中β-catenin的激活是否与Dkk1的表达变化有关呢?我们利用qRT-PCR和Western blot对小鼠肠道肿瘤中Dkk1的表达水平进行了检测。发现Dkk1在Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中的表达水平有显著的下调。Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中β-catenin的过度激活以及其肿瘤加剧可能与Ifngr1缺陷导致的Dkk1表达下调有关。随后,我们利用人结肠癌细胞系HCT15细胞对IFN-γ调控β-caten in的作用机制进行了研究。我们发现,IFN-γ抑制HCT15细胞增殖的同时可以明显降低β-catenin在细胞核的聚集,同时显著抑制TOP/FOP FIash荧光素酶活性。IFN-γ对β-catenin的抑制作用依赖于DKK1的表达上调,利用DKK1抗体中和DKK1的活性可以拯救IFN-γ对β-catenin的抑制作用。STAT1是IFN-γ信号通路最关键的下游转录因子。利用抑制剂分别抑带STAT1和STAT3的活性,然后检测DKK1的表达情况。发现,STAT1活性被抑制之后,IFN-γ依然可以诱导DKK1的表达上调；而抑制STAT3之后DKK1则不能被IFN-γ诱导,说明,在结肠癌细胞中IFN-γ诱导的DKK1上调并不依赖于STAT1,而是依赖于STAT3.Liddle等发现缺失Stat1的ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生发展并没有发生改变。而Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠和IFN-γ+/-ApcMin/+肠道肿瘤明显增多IFN-γ诱导的DKK1表达上调不依赖于STAT1,一定程度上对这个问题做出回答。第四部分IFNGR1的表达水平与人类结肠癌发生发展的关系IFN-γ信号通路在肠炎以及结直肠癌的发生发展中发挥着重要作用,IFN-γ信号通路中很多相关分子的突变都被发现与人结直肠癌的发生以及病人的预后具有相关性。IFN-γ表达不足或者Ifngr1的缺失可以导致ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发生发展加剧。体外实验也发现IFN-γ可以对结肠癌细胞的生存有明显的抑制作用。如果IFN-γ通路上调不利于肿瘤发生,可以预期在形成的肿瘤中IFN-γ通路应该处于下调状态。因而我们比较了ApcMin/+小鼠肠道肿瘤和正常组织中Ifngr1的表达水平。结果发现,Ifngr1在ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中的表达水平比显著低于正常肠道粘膜组织。我们猜测,这可能是肿瘤形成和发展过程中选择的结果。ApcMin/+小鼠肠道肿瘤起源于微腺瘤,但是并不是所有的微腺瘤都可以发展为大腺瘤或恶性肿瘤。在肿瘤的发生过程中,IFN-γ起到免疫监控的作用。Ifngr1表达水平高的细胞,对IFN-γ敏感,肿瘤的生长受到一定程度的抑制；而Ifngr1表达水平低的微腺瘤,对IFN-γ不敏感,更容易逃逸免疫监控,从而最终发展为大腺瘤。随后,我们比较了65例结肠癌病人肿瘤和正常肠道粘膜中IFNGR1的表达水平(GSE20842),也得到相同的结论,IFNGR1在人结肠癌肿瘤中低表达。既然IFNGR1在人类结肠癌肿瘤中低表达,IFNGR1是否与结肠癌病人的预后生存有关?利用网络资源分析了226例(GSE14333)和177例(GSE17536) IFNGR1表达水平与结肠癌病人生存期的关系.。虽然差异并不显著,但结果提示,IFNGR1表达水平过高或过低都不利于病人预后。IFNGR1的表达水平适中对结肠癌病人的预后最为有利。综上所述,本论文发现,IFN-γ信号通路在ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。Ifngr1缺失会导致ApcMin/+小鼠贫血加剧、寿命缩短,肠道肿瘤的数目明显增多,肿瘤增殖加快,肿瘤恶性程度增加。同时,Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤相关炎症反应加剧,肿瘤巨噬细胞向着具有促瘤作用的M2型极化。Ifngr1-/-ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中的β-catenin进一步激活,而且β-catenin的激活由Dkk1的下调介导。IFN-γ对Dkk1的诱导不依赖于STAT1.我们还发现,Ifngr1在ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中低表达。本论文的研究结果拓宽并加深了对结肠癌的发病原因和恶化机制的认识,也为IFN-γ在结直肠癌肿瘤临床治疗中的应用提供了重要的理论依据。