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研究背景和目的肿瘤转移是一个多因素参与、多阶段发展的极其复杂的动态过程。肿瘤细胞脱离原发灶，侵入血管或淋巴管中，形成循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）。然后CTCs通过血液循环系统在远隔器官中溢出、增殖，最后形成转移灶。失巢凋亡是细胞与细胞外基质或邻近细胞失去接触而导致的一种特殊的细胞死亡方式，在组织发育和机体平衡中起着重要作用，也是肿瘤细胞转移的一道屏障。然而，部分CTCs形成某种机制逃逸失巢凋亡，得以存活下来并播散到全身。中期因子（midkine，MK）是糖胺聚糖或肝素结合生长因子家族的成员之一，在许多恶性肿瘤中高表达，并参与肿瘤发生、转移过程。以前我们的研究表明，MK在肝癌组织和血清中表达增高，并且与肝癌肝内转移和CTCs形成有关。我们推测MK可能参与失巢凋亡抵抗机制，介导肝癌CTCs在血液循环中存活的调节。本课题通过悬浮培养肝癌细胞，建立失巢凋亡模型，并验证该模型的可行性，为后续MK诱导的抗失巢凋亡实验奠定基础。然后通过体外细胞实验研究MK诱导肝癌细胞抵抗失巢凋亡的特性，初步探讨可能涉及的分子机制。研究方法1.悬浮培养肝癌细胞，建立失巢凋亡模型。将肝癌细胞接种于铺有Poly-HEMA胶的6孔板中进行悬浮培养，并与贴壁培养进行比较研究。（1）光镜下观察在不同培养条件下肝癌细胞的生长状态和形态学变化。（2）TUNEL法检测细胞凋亡。（3）流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染法）检测细胞凋亡和细胞周期的变化。2.研究MK促进悬浮培养的肝癌细胞凋亡抵抗、增殖和侵袭的作用。（1）流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染法）检测细胞凋亡。（2）MTS法检测细胞增殖。（3）Transwell法检测细胞侵袭。3．研究MK诱导肝癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制。（1）免疫荧光染色法检测悬浮培养的肝癌细胞经MK处理后NF-κB表达的变化。（2）流式细胞术检测悬浮培养的肝癌细胞经MK、AKT抑制剂和NF-κB通路抑制剂单独或联合处理后细胞凋亡率的变化。（3）Western Blot分析悬浮培养的肝癌细胞经MK处理后NF-κB、AKT信号通路关键分子及相关凋亡蛋白Bcl-2和caspase-3的表达变化。实验结果1.建立了肝癌细胞失巢凋亡模型。（1）悬浮培养的肝癌细胞体积缩小，形态变圆，并聚集成团生长。（2）TUNEL染色结果显示，悬浮培养的肝癌细胞晚期失巢凋亡明显高于贴壁培养的相同肝癌细胞，晚期失巢凋亡率分别为（28.76±3.49）%vs.（5.42±0.79）%。差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）流式细胞术检测结果显示，在悬浮培养和贴壁培养条件下，Hep3B肝癌细胞总凋亡率均随着时间延长（72h内）而增高，呈时间依赖性；在不同时间点（24h、48h和72h），悬浮培养的肝癌细胞失巢凋亡均明显高于贴壁培养的相同肝癌细胞，总凋亡率之间均有统计学意义（P<0.05）；PI染色结果表明，随着培养时间延长（24h、48h和72h），G1期细胞比率逐渐增加，分别为44.17%、57.99%和66.99%。细胞静止在G1/S期。2．MK能够增强悬浮培养的Hep3B肝癌细胞失巢凋亡抵抗、增殖和侵袭能力。（1）MK能够诱导悬浮培养的Hep3B肝癌细胞抵抗失巢凋亡。用不同浓度MK（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL）处理悬浮培养的肝癌细胞24h后，凋亡率明显低于MK未处理组，且具有浓度依赖性，分别为（19.38±2.07）%、（15.63±1.63）%和（11.53±2.11）%vs.（24.31±2.49）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）MK能够促进悬浮培养的Hep3B肝癌细胞增殖。MK作用于悬浮培养的肝癌细胞48h后，随着MK浓度增加细胞增殖逐渐上升。各处理组均高于未处理组（P<0.05）。（3）MK能够提高悬浮培养的Hep3B肝癌细胞侵袭能力。Transwell检测结果显示，与未处理组相比，MK处理组肝癌细胞侵袭能力明显增强，在10ng/mL-100ng/mL范围内呈浓度依赖性。未处理组肝癌细胞穿膜数为（15.02±1.82）个/视野，处理组（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL）分别为（35.04±3.27）个/视野、（53.33±3.09）个/视野、（78.32±5.44）个/视野和（74.96±4.32）个/视野，差异有统计学意义（P<0.05）。3．MK通过活化NF-κB和AKT信号通路诱导肝癌细胞抵抗失巢凋亡。（1）经MK处理后，悬浮培养的肝癌细胞NF-κB表达从胞质转入核内。（2）经MK处理后，悬浮培养的肝癌细胞NF-κB和pAKT表达增高，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，而促凋亡蛋白caspase-3表达下调。（3）AKT抑制剂MK2206和NF-κB通路抑制剂Bay11-7802预处理能够提高MK诱导的肝癌细胞失巢凋亡率，抑制MK对上述靶分子表达的调节作用。研究结论悬浮培养的肝癌细胞凋亡率高于贴壁培养细胞；MK具有促进失巢肝癌细胞凋亡抵抗、增殖和侵袭的作用。其抵抗失巢凋亡的机制可能与MK活化NF-κB和AKT信号通路，上调抗凋亡蛋白Bcl-2和下调促凋亡蛋白caspase-3有关。