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目的:缩氨基硫脲类化合物是一类重要的亚胺衍生物,具有广泛的药理活性,如抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗疟疾等。研究发现,以缩氨基硫脲为母核的化合物,通常表现出优异的抗肿瘤活性,引起了人们的广泛关注。本课题组前期研究发现,以缩氨基硫脲为母核,并引入卤原子,如氟和溴,有利于提高化合物活性,如靶点的相互作用和特异性,代谢稳定性,膜透性和细胞毒活性。在此基础上,课题组合成氟代缩氨基硫脲类化合物,2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲,本课题以其作为研究对象,研究其体外抗肿瘤活性,并对其可能的作用机制进行探讨,为卤代缩氨基硫脲类化合物开发成新型的抗肿瘤药物提供实验依据。方法:利用MTT法筛选2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲对多种肿瘤细胞株和正常细胞株的抗增殖作用,包括人肺癌细胞A549,人结肠癌细胞Caco-2,人脑胶质瘤细胞U87,人肝癌细胞HepG2和人脐静脉内皮细胞HUVEC。采用克隆形成实验和Transwell小室实验研究2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲对A549细胞增殖和迁移能力的影响。采用PI染色法和流式细胞术探究2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲对A549细胞周期的影响,并用Western Blot检测其对相关周期蛋白表达的影响。采用Hoechst33258染色法检测2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲对A549细胞凋亡形态学的影响。Annexin V/PI双染法进一步地定量检测它对A549细胞凋亡的影响,并用Western Blot检测相关凋亡蛋白表达的变化。然后我们着重研究2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲对A549细胞线粒体凋亡通路的影响,首先采用DCFH-DA探针标记A549细胞,研究2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲对A549细胞内活性氧的影响,最后采用JC-1试剂盒检测2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲诱导A549细胞线粒体膜电位的变化。结果:MTT结果发现2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲可抑制肿瘤细胞增殖,对A549细胞,Caco-2细胞,U87细胞和HepG2细胞的IC50分别为28.52μg/mL,30.83μg/m L,86.37μg/mL和134.15μg/m L。其中2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲对A549细胞表现出最强的抗增殖活性,且对A549细胞的抗增殖活性(IC50=28.52μg/mL)优于对HUVEC细胞的抗增殖活性(IC50=49.06μg/mL),体现出一定的选择性。克隆形成实验发现2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲抑制A549细胞的克隆形成。Transwell实验结果表明2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲抑制A549细胞的侵袭。细胞周期检测结果发现2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲可将A549细胞阻滞在G0/G1期,G0/G1期的细胞比例从空白对照组的32.93%增加到2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲浓度为50μg/mL时的50.97%,与此同时,与细胞周期相关的蛋白CDK4和Cyclin D1表达含量减少。细胞凋亡检测检测结果表明2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲可显著诱导A549细胞凋亡,当2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲浓度为50μg/m L时,细胞凋亡比例从空白对照组的5.5%增至33.7%,且2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲可显著影响相关凋亡蛋白的表达,例如Bcl-2/Bax表达含量比例下降,Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3和p53蛋白表达含量均升高。线粒体凋亡通路的研究中,我们发现2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲可诱导A549细胞产生活性氧,并破坏A549细胞的线粒体膜电位,诱导其线粒体膜电位降低。以上结果表明,2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲可诱导A549凋亡和G0/G1期周期阻滞,其作用机制可能是通过活性氧介导的线粒体凋亡通路。结论:2-（3,4-二氟苯亚甲基）氨基硫脲表现出优秀的抗肿瘤活性,并通过活性氧介导的线粒体凋亡通路诱导A549细胞凋亡。本研究的发现,可为卤代缩氨基硫脲类化合物的抗肿瘤研究提供理论基础和实验依据。