【摘 要】
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已发现胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)表达谷氨酸和γ-氨基丁酸功能性受体以及其合成和释放的生物元件,但谷氨酸和γ-氨基丁酸本身是否能由ESC释放则需要特异性和灵
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已发现胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)表达谷氨酸和γ-氨基丁酸功能性受体以及其合成和释放的生物元件,但谷氨酸和γ-氨基丁酸本身是否能由ESC释放则需要特异性和灵敏度高的检测手段予以确证。目前常用的检测方法是色谱串联紫外-可见光/荧光检测法等,但由于需要衍生化处理或加入离子对试剂,容易引入杂质并降低检测灵敏度,从而影响结果可靠性。相比而言,液相色谱-质谱联用技术逐渐成为氨基酸分析的主要方法之一。由于谷氨酸和γ-氨基丁酸均为极性化合物,在常用的反相C18色谱柱上不能保留,因此本研究采用新型的亲水作用色谱(Hydrophilic Interaction Chromatography,HILIC)分离分析。该方法明显改善极性物质及离子性质化合物的保留时间、摆脱了在色谱分析前端发生的质谱离子抑制现象的影响、提高质谱离子化效率、同时有效解决了极性物质在传统C18色谱柱的弱保留问题,流动相的黏度较低也使分离速度较反相色谱快。应用该方法发现ESC可自分泌谷氨酸和γ-氨基丁酸直至达到平衡状态,为干细胞的小分子调控生物学研究提供了方法学手段和数据线索。本研究采用同位素内标、替代基质法建立了基于HILIC-MS/MS法的谷氨酸和γ-基丁酸分析方法,操作较为简单、灵敏度较高、选择性较强。从分析化学的角度直接检测到胚胎干细胞自分泌谷氨酸和γ-氨基丁酸。课题还初步讨论了HILIC色谱用于亲水性、偶极化合物分析的分离机理;并探讨了LC-MS/MS色谱检测方法在达到基线分离状态下的优越性。本方法适当经过微调可用于生物基质中的水溶性大极性小分子递质的检测和分析,对于非中枢神经系统内神经递质的研究具有科学和理论指导意义。
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