论文部分内容阅读
目的
胃癌是世界范围内最常发生的恶性肿瘤之一,在我国是肿瘤死亡的主要原因。大多数患者在诊断时已是进展期或发生远处转移,化疗是治疗晚期胃癌的主要手段。
氟尿嘧啶是胃癌化疗的基本用药,其药理作用为通过DNA和RNA两种途径,干扰胸腺嘧啶的合成。其中,DNA途径是氟尿嘧啶在胸苷磷酸化酶的催化下直接合成活性代谢产物胸腺嘧啶脱氧核苷(FdUMP),进而影响细胞DNA的合成。
卡培他滨、去氧氟尿苷等氟尿嘧啶前体药物在体内也需经胸苷磷酸化酶催化转变为氟尿嘧啶,进而发挥生物学效应。
本实验以胃癌细胞株SGC7901、MGC803为模型,对氟尿嘧啶类药物的抗瘤活性及与胸苷磷酸化酶表达水平的关系进行了研究。
方法
1、MTT法检测去氧氟尿苷对两种胃癌细胞的增殖抑制
取对数期生长的人胃癌MGC803细胞,SGC7901细胞,进行胰蛋白酶消化,消化后用培养液制成单细胞悬液,调整细胞浓度至5×104个/ml接种于96孔板,培养12小时后分别加入既定浓度的去氧氟尿苷,每孔最终体积200μl,加药分别培养24小时,48小时,72小时后,加入MTT,于相同培养条件下继续培养4h。加入DMSO,在恒温振荡器上振荡10min,室温20min孵育。放入酶标仪中以570nm波长检测光密度值(optical density,OD)。空白调零组A490的OD值均数设为零,以平行孔的平均OD值作为各组的OD值。
2、Western Blot检测两种胃癌细胞胸苷磷酸化酶表达水平
收集人胃癌MGC803细胞和SGC7901细胞进行Western Blot检测,加入抗PD-ECGF抗体孵育1h,TTBS洗膜,二抗孵育,洗膜,加入ECL发光液,孵育5min,曝光,显影,定影。
3、MTT法分别检测去氧氟尿苷和氟尿嘧啶对SGC7901细胞的增殖抑制
取对数期生长的SGC7901细胞,进行胰蛋白酶消化,消化后用培养液制成单细胞悬液,调整细胞浓度至5×104个/ml接种于96孔板,培养12小时后分别加入既定浓度的去氧氟尿苷和氟尿嘧啶,每孔最终体积200gl,加药分别培养48小时,72小时后,加入MTT,于相同培养条件下继续培养4h。加入DMSO,在恒温振荡器上振荡10min,室温20min孵育。放入酶标仪中以570nm波长检测光密度值(optical density,OD)。空白调零组A490的OD值均数设为零,以平行孔的平均OD值作为各组的OD值。
4、细胞凋亡检测
取对数期生长的SGC7901细胞,进行胰蛋白酶消化,消化后用培养液制成单细胞悬液,调整细胞浓度至3×105个/ml接种于6孔板,培养12小时后分别加入既定浓度的去氧氟尿苷和氟尿嘧啶。24小时,48小时候分别收集对照组及处理组细胞,冷PBS洗2次,加入5ulAnnexinV和10ulPI避光孵育15min,用FACScan流式细胞仪进行检测,判定凋亡百分率。CELLQuest软件进行分析。
5、Western Blot检测药物作用后细胞胸苷磷酸化酶的表达
分别收集对照组及处理组细胞进行裂解,提取细胞蛋白,取20μg处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜,5%脱脂奶封闭1h,一抗孵育1h,TBST洗膜,然后二抗孵育30min,TBST洗膜后加入ECL发光液,孵育5min,暗室中用X片曝光,显影,定影。
结果
1、高表达胸苷磷酸化酶的细胞系筛选
通过进行MTT检测,发现去氧氟尿苷作用于SGC7901细胞与MGC803细胞后,SGC7901细胞的增殖抑制明显强于MGC803细胞。通过Western Blot检测,在SGC7901细胞中,胸苷磷酸化酶表达水平明显较MGC803细胞高
2、氟尿嘧啶与去氧氟尿苷对SGC7901细胞的增殖抑制
通过进行MTT检测,发现无论是氟尿嘧啶还是去氧氟尿苷,对SGC7901细胞的增殖抑制都随着时间的延长、浓度的加大而逐渐增强。
3、氟尿嘧啶与去氧氟尿苷对SGC7901细胞的凋亡诱导
流式细胞仪分析显示,氟尿嘧啶和去氧氟尿苷能诱导SGC7901细胞凋亡,且呈时间剂量依赖性。
4、氟尿嘧啶与去氧氟尿苷对SGC7901细胞胸苷磷酸化酶表达水平的影响
通过Western Blot检测,在药物处理过的SGC7901细胞中,胸苷磷酸化酶的含量较对照组细胞明显上调,而且呈时间剂量依赖性。
结论
1、去氧氟尿苷能抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞的凋亡,其作用受细胞胸苷磷酸化酶表达水平的影响。
2、氟尿嘧啶和去氧氟尿苷能上调胃癌细胞内胸苷磷酸化酶的表达水平。