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背景:心力衰竭(心衰)是一种进行性恶化性疾病,是近年来最主要的死亡因素,严重危害到人类健康,已经成为21世纪全球范围的流行病,对卫生保健体系的影响也日益增加。致使心衰发病率升高的原因很多,其中最主要的是:人口老龄化;心梗患者的存活率提高,但预后较差;高血压患病率持续升高,但血压控制不理想。近年来,急性心肌梗死后继发的心衰在所有心衰中占有主要地位,在全球每项心衰研究中,心梗患者诱发的心衰占半数左右。因为急性心肌梗死后所引起的心肌坏死和凋亡是心力衰竭的一个先兆,致使很多患者在心梗后3个月内因心肌重塑,梗死心肌变薄并形成室壁瘤、心脏扩大,随之发生心衰,所以急需对急性心肌梗死做出规范治疗,以预防心衰的发生。一旦发生了心衰,心脏会快速进入衰竭和恶化的过程,衰竭心脏的心室重构是不可逆转的过程。所以有效治疗原发病-高血压、2型糖尿病、肥胖以及急性心梗后心室重构等可以预防或延缓心衰发生并延长生命。在我国,随着医学的发展和公民健康意识的提高,高血压、糖尿病等都得到了一定的控制,但是我国心梗后心脏重构和心衰预防不足尚具普遍性,不论介入还是溶栓治疗都没有达到预期的效果。最近的研究发现干/祖细胞可以阻碍相关心血管疾病的进展,让更多的学者开始关注再生医学对心血管疾病的治疗,特别是内皮祖细胞(EPCs)通过调节损伤部位血管修复的研究已经取得很大进展。以往EPCs在心血管疾病中治疗的结果显示:在心梗模型中通过自体EPCs移植可以改善左室功能。最近,Arshed A的研究也证实急性心肌梗死后通过冠脉内自体CD34~+细胞的植入可以减少心脏不良事件的发生,提高心功能,因此也可以预防或者延缓心衰的发生。EPCs促进血管形成过程中要经过从干细胞或者祖细胞巣中动员、迁移入外周到达损伤部位来修复受损的血管。那么我们对急性心梗和心衰患者EPCs的迁移、血管形成能力以及参与的相关因子进行研究,以确定进行干预的位点,来增强EPCs的血管修复能力。本实验成功从人动脉血中分离培养出EPCs,且方法简单,重复性好;也建立了完整的EPCs鉴定、体外扩增的实验平台;本实验分别成功分离健康人(n=4)、急性心梗患者(n=3急性心梗24小时内2个,急性心梗6天1个)、心力衰竭患者(n=3)的EPCs,体外扩增培养后比较不同人群EPCs的迁移、血管形成能力以及参与这些过程的相关因子,来详尽了解EPCs在急性心梗到心衰发展过程中功能上的改变,为后期的分子机制研究提供数据支持。目的:建立人动脉血EPCs分离、鉴定、体外扩增的稳定平台,分离培养取得健康人、急性心梗、心衰患者EPCs样品,比较其功能差异并探索调控EPCs功能差异的分子机制。方法:1、EPCs的分离:收集健康人、急性心梗患者(24h内)、慢性心力衰竭患者动脉血,用密度梯度离心法分离得到单个核细胞,经过EGM-2专用培养基进行体外诱导分化。2、EPCs的鉴定:在光学显微镜下观察细胞的形态结构;选择传3代以后的细胞,通过流式细胞术检测CD133、CD34、CD31的表达情况;通过免疫荧光检测vWF的标记情况和细胞吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)以及吸附FITC标记的Ⅰ型荆豆凝集素(FITC-UEA-Ⅰ)的能力;基质胶上血管形成实验对EPCs进行功能鉴定。3、急性心梗患者、心衰患者EPCs伤口愈合能力比较:同时接种健康人、急性心梗患者、心衰患者EPCs,进行划痕实验,计算各人群EPCs的迁移率。4、急性心梗、心衰患者EPCs的迁移能力的比较:通过Transwell小室分析各种EPCs的迁移能力。5、各种EPCs体外微血管形成能力的检测:将各种EPCs铺在基质胶上,分别在不同的时间点观察EPCs的体外血管形成能力。6、EPCs趋化因子的表达情况检测:用RT-PCR测定SDF-1及其受体CXCR4的表达情况。7、其他与迁移能力和血管形成相关因子的表达情况:通过RT-PCR检测eNOS和VEGFA的mRNA表达水平;通过NO检试剂盒检测血浆中NO的表达情况。结果:1、成功从人动脉血中分离得到EPCs;光学显微镜下可见细胞形成长梭形的早期EPCs和鹅卵石样的晚期EPCs;分离所得健康人和心衰患者EPCs可以在体外基质胶上形成微血管结构。2、流式细胞术鉴定EPCs表面抗原结果显示:其不仅表达EPCs的主要表面抗原标记CD34,而且也表达内皮相关的表面抗原标记CD31,几乎不表达干/祖细胞表面抗原CD133。3、免疫荧光鉴定EPCs标志物结果显示:激光共聚焦显微镜下观察内皮细胞表面标志vWF表达阳性,说明祖细胞逐渐表现出内皮细胞的特性;EPCs吞噬Dil-ac-LDL后在激光共聚焦显微镜下呈红色荧光,吸附FITC-UEA-I后在激光共聚焦显微镜下呈现绿色荧光,正在分化的EPCs既可以吞噬Dil-ac-LDL又可以吸附FITC-UEA-I在激光共聚焦显微镜下呈现黄色荧光。4、划痕实验结果显示:血清刺激前后急性心梗EPCs的伤口弥合速度均比心衰EPCs快。5、细胞迁移实验结果显示:急性心梗患者比心衰患者EPCs的迁移率高。6、体外基质胶上血管形成实验结果显示:急性心梗患者EPCs不能在基质胶上形成血管结构,用自身血清刺激后也不能形成血管结构;心衰患者EPCs在体外基质胶上可以形成血管结构;30%心衰患者血清刺激急性心梗患者EPCs后可以形成血管结构;7、RT-PCR检测各种病人EPCs的趋化因子和血管形成相关因子的mRNA表达水平,结果显示:急性心梗患者、心力衰竭患者EPCs的SDF-1、eNOS表达均高于正常人;急性心梗患者CXCR4的表达高于心力衰竭患者,两者均高于正常人;急性心梗患者VEGFA的表达低于正常人和心力衰竭患者。自身血清刺激后结果显示:急性心梗患者SDF-1、CXCR4、eNOS的表达高于心衰患者和正常人;急性心梗和心衰患者VEGFA的表达没有统计学差异。8、血浆检测NO结果显示:急性心梗患者NO的表达量高于心衰患者。结论:人动脉血中可以成功分离出EPCs;心衰患者EPCs的迁移能力弱于急性心梗患者(24h内);心衰患者EPCs的血管形成能力强于急性心梗患者(24h内);心衰患者血清促进EPCs血管形成;随着急性心梗发生的时间EPCs的迁移能力减弱,血管形成能力增强。