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研究背景胰腺癌恶性程度高,预后差,5年生存率低于5%,是恶性程度最高和预后最差的肿瘤之一。80%胰腺癌患者在诊断时已经处于晚期,肿瘤已包绕血管或者发生远处转移。同时由于其自身生物学特征,胰腺癌对放疗和化疗不敏感,有耐受性。因此研究新的治疗方案或者增加胰腺癌对放疗或者化疗的敏感性,是改善胰腺癌患者预后、延长生存时间的重要策略之一溶瘤病毒治疗是近年来兴起的一种新的肿瘤治疗方法。目前多种溶瘤病毒在进行临床试验或者临床前研究,并取得了一定成果。溶瘤痘苗病毒GLV-1h151是美国Genelux公司新近研发的溶瘤痘苗病毒,该病毒插入了具有荧光蛋白标记的RUC-GFP基因,删除了胸苷激酶基因和痘苗病毒的致病基因,使该病毒安全并能特异性在肿瘤细胞内复制,具有良好的临床应用和治疗前景。本研究拟用溶瘤病毒联合放疗在体外体内对胰腺癌干预,观察干预效果,并探索其相关分子机制,为将来的临床应用提供理论基础。研究目的1)观察溶瘤病毒GLV-1h151联合放疗对胰腺癌细胞的杀伤作用；2)探索GLV-1h151联合放疗对胰腺癌产生杀伤作用的相关分子机制；3)小鼠体内实验进一步证实GLV-lh151联合放疗对胰腺癌杀伤作用,进一步探索GLV-1h151的安全性及有效性。研究方法1)以不同的病毒滴度转染胰腺癌细胞株,在荧光显微镜下每日观察绿色荧光蛋白的表达情况,观察溶瘤病毒GLV-1h151在胰腺癌细胞内的复制。2)四株胰腺癌细胞系,每株细胞系分为四组：对照组、单一病毒组、单一放疗组及联合治疗组。以不同剂量进行干预,观察胰腺癌细胞株的活性。利用Dr. Chou CompuSyn软件计算放疗和溶瘤病毒的联合指数(combination indices, CIs)和剂量降低指数(dose-reduction index, DRI),判断溶瘤病毒联合放疗有无协同杀伤作用。3)运用病毒滴度法检测放疗组和对照组病毒复制量,观察放疗对病毒复制的影响4) Hoechst33258荧光染色检查不同治疗组胰腺癌细胞形态；流式细胞技术检测不同治疗组细胞凋亡数目。5)碘化丙锭(PI)分析不同治疗组细胞周期,检测G2/M检控点在各组中的比例情况。6)双向凝胶电泳及质谱分析技术筛选不同治疗组表达差异的蛋白,找出与细胞凋亡和细胞周期调控相关的蛋白进一步分析。Western Blot技术进一步验证筛选的差异蛋白。7)通过建立小鼠皮下移植瘤模型观察不同治疗组小鼠皮下种植瘤生长情况,记录各组小鼠肿瘤生长速度、倍增时间及小鼠体重。苏木精-伊红染色(HE)染色观察各组肿瘤标本坏死情况；病毒滴度法进一步验证体外实验结果；免疫组化染色检测各组肿瘤标本中筛选的差异蛋白表达情况。实验结果1)在GLV-11h51病毒感染细胞72小时后,绿色荧光蛋白GFP表达量随着病毒量增加而增加,表明溶瘤病毒GLV-1h151转染至胰腺癌细胞株,并能成功表达目的基因；2)单一治疗中,四种胰腺癌细胞株随着放疗剂量与病毒量的增加,存活细胞逐渐减少,呈效应-剂量依赖关系。在联合治疗中,同一时间点存活细胞数明显少于单一治疗组,结果有统计学意义。利用Dr.Chou计算机CompuSyn软件评估联合作用的效果发现,放疗和溶瘤病毒对AsPC-1、PANC-1和MIAPaCa-2三株胰腺癌细胞系联合治疗,当细胞抑制率为50%、75%和90%时,三株细胞系对应的CI值均小于一,说明放疗和溶瘤病毒GLV-1h151联合治疗对三株胰腺癌细胞均产生了协同杀伤作用,且对AsPC-1协同杀伤作用最强。3)用空斑实验检测放疗对病毒复制的影响,结果表明放疗对溶瘤病毒复制没有影响,放疗组和对照组间的病毒复制量无明显差异。表明放疗与溶瘤病毒联合治疗产生的协同效应并不是由病毒复制量增加引起的,可能存在其他促进细胞凋亡的途径。4) Hoechst33258荧光染色观察细胞核形态变化实验结果显示,单一病毒组和联合治疗组开始出现细胞核形态改变,联合治疗组细胞核形态变化显著、染色质明显浓缩,细胞核呈致密浓染,同时伴有广泛细胞死亡。5)流式细胞仪技术检测不同治疗组在干预第24小时、48小时细胞凋亡情况。结果显示在AsPC-1细胞系中,在干预第24和48小时时间点,联合治疗组的细胞凋亡率显著多于单一放疗组和单一病毒组,分别为：0.47±0.07vs.0.16±0.10vs.0.31±0.04,P<0.05;0.54±0.04vs.0.19±0.02vs.0.40±0.04,P<0.05。在其他两株细胞系MIAPaCa-2和PANC-1细胞得到结果类似。6)用PI staining方法检测单一和联合治疗后胰腺癌细胞周期的变化。结果显示在AsPC-1细胞中,在干预24小时和48小时时间点中,对照组、单一放疗组、单一病毒组和联合治疗组中,G2/M期数量分别为：0.10±0.02vs.0.77±0.01vs.0.08±0.02vs.0.24±0.01;0.21±0.04vs.0.78±0.04vs.0.09±0.02vs.0.06±0.02；联合治疗组G2/M期数量显著少于单一放疗组,结果有统计学意义。MIAPaCa-2和PANC-1细胞株中也观察到相似结果。7)二维凝胶电泳和质谱技术鉴定放疗组和放疗联合溶瘤病毒组凝胶图像的差异蛋白。通过PDQuest软件进行成组比较,共计筛选出20中表达差异的蛋白。在筛选的20个差异蛋白中,联合治疗组与放疗组相比,上调蛋白3个,其余为下调蛋白17个。通过复习文献发现14-3-3a与细胞周期及细胞凋亡调控最为密切相关。我们拟对14-3-3a作为靶点进行研究。Western Blot实验结果证实了蛋白质组学筛选的差异蛋白及我们的推测,14-3-3σ在联合治疗组中的表达显著较单一放疗组降低,并且随时间延长,该差异蛋白表达量在24小时比12小时较低。另外我们研究发现,与14-3-3σ相互作用密切的CyclinB1和CDKl(Cdc25)表达也发生相应变化。与单一放疗组相比,联合治疗组中CyclinB1和CDKl表达显著降低。8)观察不同治疗组小鼠及皮下肿瘤生长状况。结果显示在干预后第4和5周时,皮下肿瘤体积在对照组、单一病毒组、单一放疗组及联合治疗组已经出现显著差异,在第5周时,各组小鼠皮下肿瘤体积分别为：2478.6±242.9mm3;1574.6±96.4mm3;1795.7±202.3mm3及117.0±14.7mm3。同时各组肿瘤生长体积倍增时间在对照组、单一病毒组、单一放疗组及联合治疗组分别为：13.5±2.31天；28.6±5.81天；15.2±4.23天和33.0±6.47天,肿瘤对治疗反应在联合治疗组中显著强于单一治疗组。连续观察至实验结束,各组小鼠体重无显著差异。9)取干预后第7天的皮下肿瘤制作石蜡切片,并行苏木素-伊红染色。镜下观察小鼠皮下肿瘤组织。对照组镜下观察发现细胞生长良好,细胞排列紧密,核大深染。单一病毒组和单一放疗组细胞有凋亡和坏死,细胞核碎裂可见,部分细胞崩解。联合治疗组细胞凋亡和坏死最为明显,视野中仅剩少量残余碎裂的细胞核,看不到完整细胞。10)体内观察放疗对病毒复制的影响结果所示,放疗组病毒复制量显著低于对照组,且接受4Gy剂量组病毒复制量显著低于接受2Gy放疗剂量组。进一步证实了放疗并没有通过增加溶瘤病毒GLV-1h151复制量来产生协同杀伤肿瘤细胞作用。11)取干预后第7天的皮下肿瘤制作石蜡切片,采用免疫组化方法观察不同治疗组14-3-3σ、CyclinB1和CDK1蛋白的表达情况。结果显示14-3-3σ、CyclinB1和CDK1三种蛋白在单一放疗组呈强阳性,在联合治疗组中表达较弱,甚至不表达。该结果进一步证实了与单一放疗组相比,联合治疗组14-3-3σ疗表达显著降低,同时其下游调控蛋白CyclinB1/CDK1复合物表达与其一致,也是在联合治疗组比单一放疗组中表达降低。研究结论1)溶瘤病毒GLV-1h151可以转染胰腺癌细胞,与放疗联合可以对胰腺癌产生协同杀伤作用。2)溶瘤病毒GLV-11h51可以降低14-3-3σ、CyclinB1和CDKl蛋白的表达,由此可以降低胰腺癌细胞G2/M检控点的数目,被放疗损伤的DNA未能完全修复就进入了有丝分裂期,通过有丝分裂性灾难促进细胞凋亡。3)小鼠皮下胰腺癌种植瘤模型进一步证实了肿瘤对溶瘤病毒GLV-1h151联合放疗的治疗反应强于单一治疗组。体内实验也进一步证实溶瘤病毒GLV-1h151通过降低14-3-3a、CyclinB1/CDKl复合物表达来增加胰腺癌放疗敏感性。这为将来GLV-1h151应用于临床提供了理论基础。