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大豆是植物蛋白及油脂的重要来源,在我国广泛种植。通过基因工程的方法对大豆进行有目的改良,是一种较常规育种更为有效、快速的方法,是现代生物技术在生产实践中的具体应用。但大豆与其他作物相比,在遗传转化操作技术上有一定的困难,主要体现在转化效率低,转化后植株再生频率低及重复性差等方面。建立理想、高效的大豆转化体系,是目前的研究热点之一。
农杆菌介导的转化方法是植物基因工程中较为常用的方法之一,在利用农杆菌介导的遗传转化技术中,有许多因素对转化效率和转基因植株的再生都有重要影响,对这些因素进行研究具有重要的应用价值。
本研究直接以农杆菌转化系统为平台,选择用于大田生产的栽培大豆中黄13、早熟18、合丰25、黑农35、绥农14、冀豆12、绥农20、郑92116、科新3号、鲁豆4号、中品661和浙春3号的子叶节为外植体,用EHAl01农杆菌菌株(含pPTN289质粒)浸染,对大豆子叶节经器官发生途径诱导丛生芽的几个重要影响因素进行了研究,同时对与农杆菌介导转化大豆频率有关的影响因子进行了优化,改善了转化条件,提高了转化率,建立了一种转化效率较高、稳定性好、通用性强的大豆转化技术体系。然后以EHAl05农杆菌菌株(含pCRI20-IND-ABP9质粒)浸染,将目的基因ABP9导入大豆进行研究,获得再生植株。
获得的主要结果如下:
1.用EHAl01农杆菌菌株(含pPTN289质粒)浸染,用基本培养基培养12个不同基因型大豆的子叶节,它们的再生转化率在18.6﹪~59.32﹪之间。从中筛选出早熟18、合丰25、黑农35三个再生和转化频率较高(49.12﹪、52.13﹪、59.3﹪)的基因型;同时它们是对农杆菌敏感的大豆基因型,表明再生率和转化效率高的基因型对农杆菌敏感性强的基因型具有一致性。
2.共培养转化条件的优化。用不同培养基对早熟18和黑农35进行共培养,经过gus瞬时表达检测,结果表明:B5基本培养基+6-BAl.67mg/1+Agar琼脂和B5基本培养基+6-BAl.67mg/l+Agrose琼脂粉的培养基为理想的培养基;葡萄糖和谷氨酰胺对诱导丛生芽具有抑制作用。
3.在诱导丛生芽阶段,对早熟18进行不同梯度的pH值试验,结果表明,pH值在5.7时,诱导的丛生芽最多,褐化和黄化的程度最轻,是最适pH值。
4.不同激素的配比使用对早熟18再生苗生根的影响。结果表明MS培养基+IBA(1.0mg/l)能提高早熟18再生苗的生根效率,可达到93.3﹪,同时缩短再生苗生根的启动时间。
5.对获得的经过EHA101农杆菌菌株(含pPTN289质粒)浸染的早熟18转基因再生植株进行检测,获得8株转基因阳性植株。初步表明bar基因已整合到大豆基因组中。
6.用EHA105农杆菌菌株(含pCRI20-IND-ABP9质粒)浸染早熟18,将目的基因ABP9导入其中进行研究,获得11株转目的基因ABP9的再生植株,进行叶片涂抹试验,结果有3株阳性植株。