论文部分内容阅读
第一部分Notch/D114和VEGF信号通路在急性髓性白血病中的表达及临床意义研究背景：血管新生是指在原有血管基础上芽生出新的血管、广泛重建后形成稳定血管网络的复杂过程,在实体肿瘤的生长、转移及预后中发挥重要作用。越来越多的研究表明,骨髓微血管密度增多(即骨髓血管新生)对急性髓性白血病(AML)的发展、化疗耐药和预后亦有重要意义。AML骨髓微环境中血管生成刺激因子(正调节)和血管生成抑制因子(负调节)的相对平衡,可控制骨髓血管生成开关,从而调控AML血管新生。其中,血管内皮细胞生长因子(VEGF)和Notch/D114信号通路可能是调节AML血管新生的两个最重要机制。VEGF信号通路是调节胚胎血管发育和肿瘤血管新生的主要信号通路,对血管发育的启动至关重要。AML中VEGF的表达失调不仅可促进血管新生,还能刺激AML细胞增殖、迁移。研究显示,在初诊AML患者中可检测到VEGF和VEGFR2表达上调,且其高表达的AML患者易出现化疗药物抵抗、预后较差,提示VEGF信号通路与AML的发生、发展及预后关系密切。最近研究显示,Notch信号通路,尤其是Notch配体D114是另一调节肿瘤血管新生的重要信号通路。Notch信号通路在细胞增殖和分化等命运决定中起关键作用,其异常调控可导致肿瘤等多种疾病的发生。D114介导的Notch信号通路活化对肿瘤细胞与邻近内皮细胞的相互作用也有重要意义,可能在AML血管新生中发挥重要的调节作用。研究表明,根据肿瘤的组织来源和细胞类型,Notch/D114信号通路可发挥促进或抑制血管新生的作用。此外,该信号通路对不同肿瘤的预后影响亦存在很大差异,可能起促癌或抑癌作用。因此,阐明Notch/Dll4信号通路在AML中的预后价值对抗AML血管新生治疗具有重要意义。研究显示VEGF信号通路在血管新生中起促进作用；Notch/Dll4信号通路则能促进血管成熟、阻断新生血管分支形成,抑制血管的过度增生,从而发挥负调节作用,提示在AML血管新生中可能同时存在这两条正、负信号调节通路。因此,只有在VEGF和Notch/Dll4信号通路的协调作用下,AML血管新生才能有序进行。综上所述,AML细胞和骨髓微环境中的内皮细胞均能分泌多种血管调节因子,并且AML血管新生依赖于这些血管调节因子的相互协调作用。因此,明确AML中血管调节因子的相互关系及临床预后意义,可揭示AML血管新生的分子病理机制,为抗AML血管新生的治疗提供新思路。研究目的：研究Notch/Dll4和VEGF信号通路分子(Notch1、Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR1和VEGFR2)在AML患者外周血和骨髓中的表达水平：探讨Notch/Dll4和VEGF信号通路在AML血管新生中的相互关系及临床意义；阐明Notch1和D114分子异常表达对AML患者的预后影响,为AML提供新的预后指标。研究方法：1.标本采集：收集122例AML患者和40例健康志愿者的外周血标本,分为初诊组(60例)和完全缓解组(62例)；收集60例初诊AML患者和40例健康志愿者的骨髓标本；收集8例初诊AML患者和5例健康志愿者的骨髓活检标本,所有初诊AML患者的骨髓活检标本中原始细胞比例大于50%。采用差速离心法分离外周血血清,采用淋巴细胞分离液分离外周血或骨髓单个核细胞。2.酶联免疫吸附试验(ELISA)去：血清离心去除细胞碎片,分装并储存于-20℃,应用ELISA方法检测血清中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的分泌。3.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)法：采用TRIzol提取细胞总RNA,使用M-MuLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,应用Real-time RT-PCR方法检测外周血或骨髓单个核细胞中Notch1、Dll4、Hes1、 VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因mRNA水平的表达。4Western blot法：采用细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白,SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,应用Western blot方法检测外周血或骨髓单个核细胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白水平的表达。5.免疫细胞化学(ICC)法：将外周血单个核细胞悬液吹匀,滴加在多聚赖氨酸包被处理的玻片上,多聚甲醛固定,应用ICC方法检测外周血单个核细胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白水平的表达。6.免疫组织化学(IHC)法：应用IHC方法检测骨髓活检组织中CD34蛋白水平的表达,即为骨髓微血管密度(MVD),评价骨髓血管新生的程度；应用IHC方法检测骨髓活检组织中Dll4和VEGF蛋白水平的表达。分析骨髓MVD与Dll4、VEGF蛋白表达的关系。7.统计分析：应用Mann-Whitney U检验、方差分析、Kruskal-Wallis检验分析AML患者组和对照组中Notch1、Dll4、Hesl、VEGF. VEGFR1和VEGFR2等血管调节因子的表达差异；应用Spearman秩相关分析各个血管调节因子表达的相关性、血管调节因子表达和临床特征的相关性：应用Kaplan-Meier生存曲线评估各组AML患者的生存率,log-rank检验比较组间生存率差异；应用单因素Cox比例风险回归模型评价各个因素对生存的预后影响,多因素Cox比例风险回归模型确定与生存相关的独立危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1Notch/D114和VEGF信号通路分子在AML患者外周血标本中的表达：①ELISA结果显示AML完全缓解组中血清VEGF浓度明显高于对照组,而初诊组中血清VEGF浓度明显低于完全缓解组,初诊组中血清VEGFR1、 VEGFR2浓度明显高于对照组；②Real-time RT-PCR结果显示初诊AML患者外周血单个核细胞中Notch1、D114、Hes1和VEGFR2基因mRNA表达水平明显高于对照组,而初诊AML患者外周血单个核细胞中VEGF和VEGFR1基因mRNA表达水平与对照组无显著差异；③Western blot和ICC结果显示初诊AML患者外周血单个核细胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白表达水平亦明显高于对照组；④Spearman秩相关分析结果显示初诊AML患者外周血Notch1与VEGFR2、Dll4与VEGFR2的mRNA表达显著相关,相关系数分别为0.483和0.426,表明AML患者外周血中存在Notch/D114和VEGF信号通路的异常激活。2Notch/D114和VEGF信号通路分子在AML患者骨髓标本中的表达：①Real-time RT-PCR结果显示初诊AML患者骨髓单个核细胞中Notch1、Dll4、VEGF和VEGFR2基因(?)nRNA表达水平明显高于对照组,而初诊AML患者骨髓单个核细胞中VEGFR1基因(?)nRNA表达水平与对照组无显著差异；②(?)Western blot结果显示初诊AML患者骨髓单个核细胞中Notch1和Dll4蛋白表达水平亦明显高于对照组；③Spearman秩相关分析结果显示初诊AML患者骨髓Notch1与D114、VEGF与VEGFR2、Dll4与VEGF的mRNA表达显著相关,相关系数分别为0.326、0.354和0.663,表明AML患者骨髓中存在Notch/D114和VEGF信号通路的异常激活。3.AML患者骨髓MVD及其与Dll4和VEGF蛋白表达的关系：①IHC结果显示初诊AML患者骨髓MVD较对照组明显增高；初诊AML患者骨髓Dll4和VEGF蛋白的表达水平较对照组亦明显增高,分别为1.27-4.63和1.49-2.92倍；②Spearman秩相关分析结果显示骨髓MVD与Dll4和VEGF蛋白的表达显著相关,相关系数分别为0.858和0.816,表明初诊AML患者骨髓MVD显著增加,且其与骨髓Dll4和VEGF蛋白的高表达呈正相关。4.AML患者骨髓标本中Notch/D114和VEGF信号通路分子表达与临床特征的相关性：①Spearman秩相关分析结果显示骨髓Notch1、Dll4和VEGF的mRNA表达水平与AML骨髓原始细胞比例显著相关,相关系数分别为0.428、0.288和0.428；②方差分析结果显示细胞遗传学各亚组间骨髓Dll4和VEGF的mRNA表达差异有统计学意义,而Notch/D114和VEGF信号通路分子的mRNA表达水平与性别、年龄及FAB分型无关。5.AML患者骨髓标本中Notch/D114和VEGF信号通路分子表达与临床预后的相关性：①AML患者的中位总生存期(OS)为25个月；②单因素Cox比例风险回归模型显示不良染色体核型、Notch1高表达、D114高表达或VEGF高表达的AML患者OS较短,多因素Cox比例风险回归模型显示染色体核型及Notch1、Dll4和VEGF的表达水平是影响AML患者OS的独立危险因素；③Kaplan-Meier生存曲线显示Dll4表达的预后价值在细胞遗传学中危组AML患者中更为显著。Notch1和Dll4表达水平是VEGF高表达AML患者的不利预后因素。结论：1.AML患者中存在Notch/D114和VEGF信号通路的异常活化,提示这两条信号通路可能在AML发生、发展中起作用。2.AML患者中D114和VEGF蛋白的异常高表达与骨髓微血管密度增高相关,提示Dll4和VEGF可能在AML血管新生中起作用。3.AML患者中Notch/D114信号通路的异常活化与预后不良有关。D114表达水平可能是细胞遗传学中危组AML患者的新预后标志。第二部分Notch/D114信号通路在急性髓性白血病体外血管新生中的作用及其与VEGF信号通路的交互作用研究背景：AML是一类以骨髓中不成熟髓细胞的异常增殖和聚集、以及骨髓造血抑制为特征,严重威胁人类健康的造血系统恶性疾患。骨髓微环境中AML原始细胞与邻近内皮细胞间的相互作用对AML的发生、进展及化疗抵抗有重要意义。我们前期研究显示初诊AML患者骨髓MVD显著增高,且其与血管调节因子的表达相关,进一步研究发现骨髓血管调节因子的高水平表达可成为独立的预后不良因素。由此可见,骨髓血管新生的程度及血管调节因子的表达在AML的发病和预后中起重要作用,抗AML骨髓血管新生有望成为AML治疗的有力手段。AML骨髓微环境可维持血管调节因子的相对平衡,控制血管生成开关,从而调控AML血管新生。研究显示,AML细胞能够分泌多种血管调节因子,刺激或抑制内皮细胞增殖,导致血管新生增强或减弱。VEGF是其中最重要的血管生成刺激因子,不仅可促进内皮细胞血管新生,还能刺激AML细胞增殖。VEGF在多种人类肿瘤中过表达,与肿瘤的发生、发展关系密切。目前,VEGF已成为极具发展潜力的肿瘤治疗靶点,通过单克隆抗体等药物靶向治疗转移性结直肠癌的研究已取得较大进展,但仍存在药物敏感性低、肿瘤细胞耐药以及药物不良反应等问题,提示在肿瘤血管新生中可能还存在更复杂的调控机制。因此,研究VEGF与其他信号通路的交互作用具有重要价值,可能为AML等多种肿瘤的多靶点分子靶向治疗开辟新途径。Notch信号通路异常调控在多种肿瘤的发生、发展中起关键作用,AML亦不例外。新近研究显示,Notch通路配体Dll4亦可参与对血管发生及生长的调控。有研究报道,D114在肾癌和膀胱癌血管内皮细胞中高表达,阻断D114信号能引起肾癌血管内皮细胞周期阻滞,抑制血管新生。然而,在小鼠胶质瘤模型的研究中发现,阻断D114信号可导致胶质瘤的血管分支增多、血管密度增加。综上所述,D114在肿瘤血管新生的调节中占重要地位,可发挥促进或抑制作用,但Notch/D114信号通路在调控AML骨髓血管新生中的作用尚不明确。研究显示,Notch/Dll4和VEGF信号通路在内皮细胞增殖分化及肿瘤血管新生中存在联系。VEGF可诱导Dll4表达,激活Notch/Dll4信号通路,说明VEGF对Notch/D114信号通路有正调节作用。而Notch/Dll14信号通路活化可减弱内皮细胞对VEGF诱导的血管新生反应,提示Notch/D114信号通路可能会反馈抑制VEGF信号通路的功能活性。另有研究显示,Notch1与基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤的侵袭、转移和血管新生中亦存在交互作用。因此,我们推测Notch/D114和VEGF信号通路或MMPs在AML血管新生的调控中很可能存在交互作用。本研究在前期工作基础上进一步探讨Notch/D114信号通路在调控AML骨髓血管新生中的作用及其与VEGF信号通路的交互作用,为抗AML血管新生的治疗提供新靶点。研究目的：研究AML细胞对共培养内皮细胞增殖、迁移及体外血管新生的影响,探讨Notch/D114信号通路在AML诱导内皮细胞功能中的作用及机制,阐明Notch/D114信号通路对VEGF信号通路的负反馈作用及机制。预期目标的实现将明确Notch/D114信号通路在AML血管新生中的重要地位,并揭示Notch/D114与VEGF信号通路在调节AML骨髓微环境血管新生中的交互作用,为AML的分子靶向治疗提供理论学依据和实验室基础。研究方法：1.细胞体外共培养模型的构建：AML细胞HL60、Kasumi、NB4、K562与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在Transwell细胞培养板中行间接共培养,或在24孔细胞培养板中行直接共培养。2.细胞增殖实验：将共培养前、后的HUVECs细胞接种于96孔细胞培养板中,应用CCK-8法检测HUVECs细胞的存活,分析AML与HUVECs细胞共培养对HUVECs细胞增殖的影响。3.细胞迁移实验：将HUVECs细胞接种于Transwell细胞培养板的上层小室中,共培养上清加入下层小室,应用Transwell细胞迁移实验检测HUVECs细胞的迁移能力,分析AML与HUVECs细胞共培养上清对HUVECs细胞迁移的影响。4HUVECs体外血管新生实验：将HUVECs细胞接种于己铺好Matrigel基质胶的12孔细胞培养板中,用共培养上清培养HUVECs细胞,应用HUVECs管状形成实验检测HUVECs细胞的体外血管新生能力,分析AML与HUVECs细胞共培养上清对HUVECs细胞体外血管新生的影响。5.细胞转染：应用Lipofectamine2000将携带Notch1小干扰片段(siRNA)或Dll4真核表达载体(pIRES2-EGFP-D114)的质粒分别转染HUVECs细胞和AML细胞NB4、K562,采用G418筛选至少2周获得稳定转染的细胞,再将AML细胞与转染的HUVECs细胞/转染的AML细胞与HUVECs细胞行直接或间接共培养。应用CCK-8法、Transwell细胞迁移实验和HUVECs管状形成实验观测转染对HUVECs细胞增殖、迁移和体外血管新生的影响。6ELISA法：将AML细胞接种于6孔细胞培养板中,离心分别收集细胞和细胞培养上清,行细胞计数；离心收集转染前、后AML与HUVECs细胞共培养上清,应用ELISA方法检测AML细胞培养上清或共培养上清中VEGF蛋白的分泌。7Real-time RT-PCR法：采用TRIzol提取细胞总RNA,使用M-MuLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,应用Real-time RT-PCR方法检测转染前、后AML或HUVECs细胞中Notch1、D114、Hes1、Hey1、Hey2、VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因mRNA水平的表达。8Western blot法：采用细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白,SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,应用Western blot方法检测转染前、后AML或HUVECs细胞中Notch1、D114和Hes1蛋白水平的表达。9.明胶酶谱法：收集AML与HUVECs细胞共培养上清,BCA试剂盒检测共培养上清的蛋白浓度,取等量蛋白上样,采用含A型明胶的SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,应用明胶酶谱法检测转染前、后AML与HUVECs细胞共培养上清中MMP2和MMP9蛋白的活性。研究结果：1.AML细胞对共培养内皮细胞功能的影响：①ELISA结果显示AML细胞HL60、Kasumi、NB4、K562培养上清中VEGF浓度较对照组明显增高；②CCK-8法检测发现,与AML细胞间接共培养后,HUVECs细胞增殖明显增强；与AML细胞培养上清共孵育后,HUVECs细胞增殖亦明显增强：而与AML细胞直接共培养后,HUVECs细胞增殖无明显变化；③Transwell细胞迁移实验发现,与AML细胞间接共培养或与AML细胞上清共孵育后,HUVECs细胞迁移明显增强；④HUVECs体外血管新生实验发现,与AML细胞间接共培养或与AML细胞上清共孵育后,HUVECs管状形成明显增多,表明间接共培养时,AML细胞可分泌VEGF,促进内皮细胞的增殖、迁移和体外血管新生。2.AML细胞对共培养内皮细胞Notch/D114信号通路的影响：①Real-time RT-PCR结果显示HUVECs与AML细胞间接共培养后,HUVECs细胞中Notch1、D114、Hes1、和Hey2的rnRNA表达水平较对照组明显升高；②、Vestern blot结果显示HUVECs与AML细胞间接共培养后,HUVECs细胞中Notch1和Dll4的蛋白表达水平较对照组亦明显升高；③明胶酶谱结果显示HUVECs与AML细胞间接共培养后,共培养上清中MMP2和MMP9的活性较对照组明显增强,表明AML细胞间接共培养可激活内皮细胞中Notch/D114信号通路。间接共培养时,AML诱导的内皮细胞功能增强可能与Notch/D114信号通路活化及其下游基因MMPs活性增强有关。3.下调内皮细胞中Notch1的表达对AML诱导内皮细胞功能的影响：①Real-time RT-PCR和Western blot结果显示Notch1siRNA转染后,HUVECs细胞中Notch1和Hes1的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显下降,而Dll4的蛋白表达水平无明显变化,说明针对Notch1的siRNA片段能有效下调HUVECs细胞中Notch1的表达；②明胶酶谱结果显示Notch1siRNA转染后,HUVECs与NB4细胞间接共培养上清中MMP2和MMP9的活性较对照组明显减弱；③CCK-8法、Transwell细胞迁移实验和HUVECs体外血管新生实验发现Notch1siRNA转染后,间接共培养中HUVECs细胞的增殖和迁移显著抑制,管状形成亦明显减少,表明间接共培养时,内皮细胞中siRNA介导的Notch1表达下调可抑制AML诱导的内皮细胞增殖、迁移和体外血管新生。4.上调AML细胞中Dll4的表达对AML细胞增殖及内皮细胞功能的影响：①Real-time RT-PCR和Western blot结果显示pIRES2-EGFP-D114表达载体稳定转染后,NB4和K562细胞中Dll4的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显升高,说明Dll4真核表达载体能有效上调AML细胞中Dll4的表达；②CCK-8法检测发现pIRES2-EGFP-D114表达载体转染后,NB4和K562细胞的增殖无明显变化,而直接共培养中HUVECs细胞的增殖显著抑制,间接共培养中HUVECs细胞的增殖亦无明显变化；③HUVECs体外血管新生实验发现pIRES2-EGFP-D114表达载体转染后,直接共培养中HUVECs细胞的管状形成明显减少,而间接共培养中HUVECs细胞的管状形成无明显变化,表明直接共培养时,AML细胞中Dll4的表达上调可抑制内皮细胞增殖和体外血管新生。5.上调AML细胞中Dll4的表达对共培养内皮细胞Notch/D114和VEGF信号通路的影响：①Real-time RT-PCR和Western blot结果显示NB4和K562细胞中Dll4表达上调后,仅直接共培养中HUVECs细胞Notch1、Hesl和Hey2的(?)nRNA表达水平较对照组明显升高,Notch1和Hes1的蛋白表达水平较对照组亦明显升高；②明胶酶谱结果显示HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,共培养上清中MMP2和MMP9的活性较对照组明显减弱；③ELISA结果显示HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,共培养上清中VEGF的浓度较对照组明显降低；④Real-time RT-PCR结果显示HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,HUVECs细胞中VEGFR2的mRNA表达水平较对照组明显降低,而VEGFR1的nRNA表达水平较对照组明显升高,表明直接共培养时,AML细胞中Dll4的表达上调可活化内皮细胞Notch信号通路,减弱其下游基因MMP的活性,并抑制VEGF信号通路。6.VEGF活化对Dll4上调诱导内皮细胞功能抑制的影响：①HUVECs体外血管新生实验发现HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,加入重组人VEGF(rhVEGF)能使HUVECs细胞的管状形成明显增多；②明胶酶谱结果显示HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,加入rhVEGF亦能使共培养上清中MMP2和MMP9的活性明显增强,表明VEGF是Dll4介导内皮细胞增殖和体外血管新生的关键分子。直接共培养时,VEGF信号通路活化可减弱D114上调对内皮细胞功能的抑制作用。结论：1.间接共培养时,AML细胞可活化VEGF和Notch/Dll4信号通路,增强MMP2和MMP9的活性,从而促进内皮细胞的增殖、迁移和体外血管新生2.直接共培养时,上调AML细胞中Dll4的表达可抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖和体外血管新生。3Notch/Dll4和VEGF信号通路在AML血管新生的调控中存在交互作用,靶向这些信号通路可能为抗AML血管新生的治疗开辟新途径。