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乳腺癌(breast cancer)是女性常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,有50万妇女死于乳腺癌,发病率占全年各种恶性肿瘤的7%~10%。在我国,乳腺癌的发病率虽较西方国家为低,但近年来亦有上升趋势。目前,以超声及X线等为主的乳腺癌诊断方法,对早期乳腺癌的诊断尚缺乏足够的准确性和特异性。而以手术,化疗及放疗主的综合治疗又因副作用太大而在临床应用中受到诸多限制。因此,许多学者把目光投向了乳腺癌的抗体诊断及治疗。近10年来,肿瘤的生物治疗已经作为一种重要的治疗模式被广泛的研究和应用于临床。但是,无论是早期利用肿瘤细胞免疫小鼠得到的多克隆抗体,还是以后运用杂交瘤技术生产的单克隆抗体都因为抗体的特异性低或者人抗鼠免疫反应(human anti-murine antibody response,HAMA)等原因而不适用于临床肿瘤治疗。直到1998年FDA正式批准人源化鼠源单克隆抗体赫赛汀(Herceptin)应用于临床CerBb2受体阳性的乳腺癌的治疗,才为肿瘤的抗体治疗带来了新的挈机。但是在临床使用中发现这种被寄予厚望的单克隆抗体仅能对30%的Her2/neu阳性的乳腺癌患者产生抗肿瘤效果。Micheu等认为单克隆抗体分子量较大,组织穿透性差,使其在肿瘤部位的浓聚减少是Herceptin治疗效果不甚理想的一个重要原因。1985年Smith提出了噬菌体展示技术的概念及1990年Huse成功的构建第一个噬菌体组合文库为肿瘤的诊断及治疗提供了一种全新的方法。噬菌体单链抗体分子量较小、组织穿透性强、能够迅速到达靶抗原部位,在肿瘤的诊断及治疗中有很强的应用价值。但是,目前报道的抗乳腺癌噬菌体抗体库多为鼠源性,因人抗鼠免疫反应而不适合临床运用。针对鼠源性单链抗体的异源性问题我们尝试利用乳腺癌患者癌旁淋巴细胞来构建人源乳腺癌抗体文库,并利用乳腺癌细胞株MCF-7进行筛选。目的:利用基因工程方法和噬菌体抗体库技术构建人源乳腺癌单链抗体文库,并从中筛选出特异性的噬菌体单链抗体,为乳腺癌的免疫诊断及免疫治疗提供新载体。方法与结果:噬菌体抗体文库的构建:1.人源单链抗体基因文库的构建:取乳腺癌患者癌旁淋巴结作为B细胞的来源,提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR的方法分别扩增抗体重链可变区(V_H)和抗体轻链可变区(V_L)基因片断。再以V_H和V_L基因片断为模板分别扩增V_H-linker与V_L-linker,然后利用SOE-PCR技术将他们拼接成完整的单链抗体(scfv)基因片断。最后,在抗体基因片断的两端引入酶切位点SfiI和NotI。结果显示:从乳腺癌癌旁淋巴结中提取的总RNA在琼脂糖电泳结果中可见明显的28S和18S条带;VH基因片断的大小约350bp和V_L基因片断的大小约300bp;组装后的Scfv基因片段约750bp。2.噬菌体单链抗体库与噬菌体载体pCANTAB-5E的拼接:制备转化效率达到6.5×10~7cfu/ug PUC18的高浓度电转菌TG1。单链抗体基因片断经SfiI和NotI双酶切后,电转感受态大肠杆菌TG1,结果获得4.2×10~7 cfu/ug氨苄青霉素抗性克隆。随即进行酶切反应鉴定,阳信插入率为79%(19/24)。随即测序结果证实抗体重链和轻链以整码的单链抗体方式准确的插入了载体。噬菌体抗体文库的初步筛选:1.利用正常的人成纤维细胞和乳腺癌细胞MCF-7对抗体库进行富集筛选:先以正常人成纤维细胞对抗体库进行负性筛选,然后再利用MCF-7对抗体库进行富集,共进行了5轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选。得到一个4.2×10~7的噬菌体抗体库,说明特异性的scFv得到了有效富集。2.噬菌体scfv的ELISA鉴定:对第五轮后的噬菌体抗体随即进行ELISA检测,结果显示:3/12的克隆呈阳性反应。结论:针对鼠源性单链抗体在临床应用中存在的人抗鼠免疫反应的问题,我们尝试利用噬菌体抗体库技术构建乳腺癌相关人源单链抗体库,并利用乳腺癌细胞进行初步筛选。结果表明通过噬菌体抗体库技术可以直接从肿瘤病人癌旁淋巴结中获得肿瘤相关的完全人源的基因片断。