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随着不孕症患者的逐年增多,对于人类辅助生殖技术(ART)来说,如何提高临床妊娠率非常重要。而妊娠的达成需要较好的胚胎质量和优良的子宫环境。目前对于胚胎质量来说,较多的评价依赖于胚胎的形态学标准,然而,依靠胚胎形态学的主观观察来预测妊娠结局是受限制的。最近的许多研究都集中于研究来源于卵母细胞微环境的非侵入性生物学标志物,来提高胚胎选择的精确性。游离DNA(cf DNA),是游离核酸的一种,为双链DNA分子,且有着比基因组DNA更低的分子量,主要来源于坏死或者凋亡的进程。最早是1948年被Mendel和Metais在血浆中发现。近年来被广泛研究于肿瘤、妇产科等领域。多项研究发现血液中cf DNA水平在一些癌症和严重疾病的患者体内是升高的,基于此,cf DNA已经被用于非侵入性的生物学标志物来早期诊断和判断某些疾病的预后。而基于母体血液中胎儿cf DNA的非侵入的产前诊断检测,也构成了妇产科的一种很有前景的方法。目前,有研究发现卵泡液中的cf DNA水平与胚胎质量存在着负相关。如果卵泡液中的cf DNA含量确实与胚胎质量存在着密不可分的关系,应用其对胚胎质量进行非侵入性的预测将会是一种很有前景的方法。本研究通过对卵泡液中cf DNA含量与胚胎质量的关系探讨,首先验证了国外关于卵泡液中cf DNA水平与胚胎质量关系的研究,确实呈现负相关。进而通过cf DNA与氧化应激及凋亡的关系,进一步探讨cf DNA与胚胎质量存在关联性的原因。目的人卵泡液中cf DNA含量与胚胎质量之间是否存在相关性,并探讨cf DNA能够影响胚胎质量的原因。材料与方法1.实验材料:研究选取了从2014.09-2015.02于郑州大学第三附属医院生殖中心行新鲜周期体外受精(in vitro fertilization IVF)或卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕治疗的189位患者,取卵日分别收集每位患者的所有卵泡液。入选患者纳入标准为:1.年龄≤40岁;2.体重指数:18-25kg/m2;3.月经周期21-35天,内分泌正常;4.未发现有卵巢或子宫器质性病变者;5.治疗方案为黄体中期短效长方案。剔除标准:女方不孕原因为多囊卵巢综合症、反复流产史、粘膜下层肌瘤,子宫粘连、子宫内膜异位症、HPV感染等的患者。2.方法:(1)分别使用酚氯仿异丙醇法(方法A)、改良酚氯仿异丙醇法(方法B)、Qiagen试剂盒法(方法C)量化其中48份卵泡液的cf DNA含量,得出最佳检测方法。余下的141份卵泡液选用最佳法进行检测;(2)在189份卵泡液中随机选取20份卵泡液,使用淋巴细胞分离液梯度分离出其中的颗粒细胞,将颗粒细胞随机分为四组,每组5例,分别加入不同浓度cf DNA进行共培养24h;(3)使用QRTPCR分别检测每组氧化应激相关因子的m RNA表达量;(4)使用Western-Blot检测加入cf DNA后不同时间段相关凋亡因子的蛋白表达量;(5)使用流式细胞仪分别检测每组的凋亡率。3.统计学方法:用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,计数资料用t检验,计量资料用X2检验,相关分析用Spearman相关检验,P<0.05为差异有统计学差异。结果1.卵泡液中cf DNA提取方法比较的结果:酚氯仿异丙醇法(方法A)、改良酚氯仿异丙醇法(方法B)、Qiagen试剂盒法(方法C)这三种方法的OD值分别为(1.72±0.06),(1.69±0.05),(1.75±0.03),没有明显差异;方法A所测得的cf DNA含量(1.518±0.095mg/ml)明显低于方法B(1.825±0.114 mg/ml)和C(1.838±0.106mg/ml),差异有统计学意义(P<0.05),方法B和方法C效果相当,没有显著差异,但方法C花费较之方法B昂贵。2.优胚率与cf DNA的相关性分析:优胚率与cf DNA含量呈负相关,相关系数为-0.865,且P<0.05。3.氧化应激相关因子的m RAN表达量:FOXO1、TRAIL、Caspase-3、Fas L、Fas五个因子的m RAN表达量随着培养基中cf DNA浓度的升高(从0mg/ml到6mg/ml)逐渐升高,且与对照组比较,均有统计学意义(p<0.05)。4.死亡受体途径中相关凋亡因子的蛋白表达量:当培养基中cf DNA浓度为2mg/ml时,随着培养时间增加(0h、2h、4h、8h),活化的Caspase-8、Fas L、Fas的蛋白相对表达量增加,活化的Caspase-3虽然在培养时间2h时,蛋白相对表达量有稍许下降,但在随后4h、8h的检测时,其相对表达量呈上升趋势,且与对照组相比,均有统计学意义(p<0.05)。5.凋亡率的比较:当在培养基中加入cf DNA浓度分别为0mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml时,共培养24h后,凋亡率分别为13%、24%、34%、48%,且与对照组相比,均有统计学意义(p<0.05)。结论1.改良酚氯仿异丙醇法(方法B)是三种方法中性价比最高的量化卵泡液中cf DNA的方法,而Qiagen试剂盒法是最为简单易操作的方法。2.cf DNA与优胚率负相关,可能是由于卵泡发生过程中cf DNA导致氧化应激,进一步触发颗粒细胞凋亡,使颗粒细胞凋亡率增高,卵母细胞质量下降,进而导致胚胎质量下降引起的。3.cf DNA可能是一个很有潜力的预测胚胎质量的非侵入性检测指标。