纳豆激酶热稳定性的突变及其在基因工程菌中的表达

• 作 者: 蒙新睿
• 出 处: 辽宁大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 纳豆激酶 定点突变 热稳定性 基因工程

在发酵纳豆类食物的过程中,纳豆发酵菌能够生产出一种碱性丝氨酸蛋白酶,即纳豆激酶(Nattokinase,NK)。纳豆激酶能够有效的溶解纤维蛋白(人体内血栓的主要成分),其作为一种新型溶栓类药物或者保健食品,与同类尿激酶等产品相比具有着生产原料价格低廉、安全性高等优势,具有广阔的市场前景。在纳豆激酶工业生产过程中,由于蛋白质分子的结构的破坏会出现热损耗高、酶活性低等现象。通过分子生物学手段,对纳豆激酶进行改造以提高其热稳定性和酶活性,以获得适应纳豆激酶大规模工业化生产的基因工程菌。本实验选择使用pET-26b原核表达载体,分别构建了含有纳豆激酶成熟肽、前导肽+成熟肽的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21中。在经过IPTG诱导表达后,离心收集菌体,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达。纤维蛋白板法检测表达蛋白的酶活。结果显示,纳豆激酶成熟肽及前导肽+成熟肽在大肠杆菌中均可成功表达;成熟肽表达的上清液和沉淀,均未表现出纤溶活性;前导肽+成熟肽表达的上清液表现出纤溶活性,而沉淀未表现出纤溶活性。通过文献阅读和生物信息学预测,筛选出166位甘氨酸,xxx(具体位点涉及保密内容,暂不公布)位丝氨酸可能对纳豆激酶热稳定性产生影响。利用重叠延伸PCR技术将166位甘氨酸突变为精氨酸、xxx位丝氨酸突变为脯氨酸。分别构建了原核表达载体pET-26b-NKt166、pET-26b-NKtxxx,并转入大肠杆菌BL21中。在经过IPTG诱导表达后,离心收集菌体,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达。纤维蛋白板法检测表达蛋白的酶活。结果显示,NKt166和NKtxxx在大肠杆菌中均可成功表达;NKt166表达的上清液和沉淀,均未表现出纤溶活性;NKtxxx表达的上清液表现出纤溶活性,而沉淀未表现出纤溶活性。经过不同温度处理后,同野生型相比,NKtxxx的热损失率降低了15.23%,而且其完全失活温度从63℃提高至65℃;同时,其纤溶活性提高了18.10%。本实验选用高效毕赤酵母表达载体pGAPZα-a,构建了含有纳豆激酶前导肽+成熟肽的真核表达载体pGAPZα-a-NKt,并转入毕赤酵母x-33中,在经过甲醇诱导表达后,收集上清液,SDS-PAGE检测蛋白表达。纤维蛋白板法检测表达蛋白的酶活。结果显示,NKt在毕赤酵母x-33中能够表达一种分泌型蛋白,纤维蛋白平板显示其上清液中蛋白不具有纤溶活性。