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棉花是重要的纤维作物和油料作物,在我国国民经济中占有非常重要的地位。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的一种土传维管束系统病害,严重影响棉花的产量与品质。一般认为大丽轮枝菌是从棉花的根部直接进行侵染,并通过表皮、皮层进入维管束组织。在维管束中形成大量的分生孢子和菌丝,阻塞导管,导致叶片萎蔫。此外,大丽轮枝菌产生的毒素和酸性糖蛋白也可以导致棉花的快速萎蔫。关于土传病原真菌进行叶面侵染的报道并不常见。在本研究中我们观察了大丽轮枝菌在棉花叶片进行侵染和系统扩展的过程,棉叶中防御物质的产生及大丽轮枝菌对禾本科单子叶植物的侵染情况。通过涂抹的方法将绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌V1070-GFP接种在离体棉花叶片的上表皮,发现接种2小时后V1070-GFP的孢子便可以萌发,接着菌丝伸长并通过气孔或者直接穿透的方式进入表皮细胞内部,而进入细胞内部的部分菌丝又可以从气孔或者以直接穿透的方式进入空气中。将10μLV1070-GFP接种在棉花幼苗的叶片后,发现V1070-GFP的孢子可以吸附在棉花叶片,接种2天后会在接种部位出现褐色病斑,随后病斑的面积不断扩大。在接种部位大丽轮枝菌的孢子萌发,菌丝伸长并可以沿着叶片扩展。伸长的菌丝沿着叶柄表面继续向下扩展到达茎部和根部,且胚轴处菌丝的量要明显多于茎的其他部位。此外,我们发现大量分生孢子和微菌核在胚轴处形成,这些分生孢子和微菌核可以重新萌发,并在胚轴处横向穿透表皮细胞、皮层进入维管束,继而向下扩展。利用稀释分离法对叶片中的V1070-GFP进行分离,发现在接种的前10天,V1070-GFP的量迅速增加,10-30天内,叶片中大丽轮枝菌的数量增加缓慢,趋于稳定。分别利用苯胺蓝染色和DAB染色的方法,观察了接种大丽轮枝菌后棉花叶片中胼胝质和过氧化氢的积累情况。发现接种V1070-GFP后,可以在接种位点观察到胼胝质的沉积,并且随时间的延长胼胝质的量不断增加。接种V1070-GFP 24小时后,在侵染叶片中观察到过氧化氢的大量积累。此外,我们还通过荧光定量PCR检测了防御基因PR1基因、LOX基因和WRKY4基因的表达情况。定量结果表明,在病原菌的诱导下,3个基因的表达量呈现出不同程度的上调。利用洋葱表皮观察了V1070-GFP孢子的萌发和侵染情况,发现V1070-GFP的孢子可以沿着洋葱表皮细胞的细胞壁进行萌发和扩展,但是其萌发的速率和菌丝扩展的速度要比在棉叶表皮上慢。此外,菌丝不能侵入到洋葱表皮细胞内部。利用体视显微镜观察V1070-GFP在水稻和玉米根部的吸附情况,采用稀释分离法对灌根处理的水稻和玉米根内的V1070-GFP进行分离。结果表明大丽轮枝菌不能吸附在玉米和水稻的根部,也未从根内部分离出V1070-GFP。此外,我们还观察了大丽轮枝菌V1070-GFP在水稻和玉米叶片上的侵染情况,发现V1070-GFP的孢子悬浮液大多呈滴状吸附在叶片上,液滴不被叶片吸收且病原菌的孢子也不会萌发。极个别部位的孢子悬浮液被吸干,这些部位的孢子开始萌发但是菌丝不能进入叶片内部,也不会导致叶片产生病斑。通过农杆菌介导的转化方法,将绿色荧光蛋白基因sGFP导入落叶型大丽轮枝菌VD07038,将红色荧光蛋白基因mCherryRFP导入非落叶型大丽轮枝菌Bp2中,分别获得了具有绿色、红色荧光信号的阳性转化子。经过分子验证和连续继代培养,证明了这些转化子具有遗传稳定的对潮霉素的抗性。通过对转化子的菌落形态、生长速度和致病力进行检测,发现大部分转化子与野生型基本一致,少量转化子发生变异。利用荧光显微镜观察了转化子VD07038G-10在感病棉花品种苏棉22幼苗根部的侵染情况。发现在接菌12 h后VD07038G-10的孢子可吸附在根表面；接种7-9 d后,菌丝入侵到棉花根部的维管组织。本研究发现大丽轮枝菌可以侵染棉花幼苗的叶片,并通过系统扩展到达茎部和根部,导致病症的产生；受大丽轮枝菌侵染后,棉花叶片中会产生一系列防御反应来抵御病菌的侵染；大丽轮枝菌能够在单子叶禾本科植物水稻和玉米叶片上萌发,但不能侵入叶片内部,说明大丽轮枝菌与寄主之间存在某种识别机制。这些结果为研究大丽轮枝菌的循环史和致病机理提供理论依据。