香蕉线条病毒基因克隆及遗传转化体系的建立

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本文根据已报道的香蕉线条病毒(Banana streak,virus,BSV)株系基因组全长序列设计引物,对BSV广东分离物(BSV-GD)核苷酸序列进行了全长扩增、克隆与序列分析,并构建了携带BSV ORF3基因片段的植物表达载体;对香蕉细胞悬浮系(Embryogenic cell suspension,ECS)的建立、影响ECS理想起始材料胚性愈伤组织诱导和体细胞胚发生途径植株再生能力等的一些因素进行了优化;采用根癌农杆菌介导法将BSV ORF3基因片段导入香蕉的ECS中,获得的主要结果如下: 1.对香蕉线条病毒BSV-GD分离物的全基因组进行了克隆和序列测定,结果表明:GD分离物完整基因组全长6950 bp,含有三个开放阅读框,ORF1全长534bp,编码177aa;ORF2全长405bp,编码134aa;ORF3全长5,130bp,编码1,709aa。与GenBank上的其他分离物进行核苷酸序列同源性比较,与来源于尼日利亚的BSV-OL分离物相应核苷酸序列相似性高达99.2%,而与其它来源的分离物(厄瓜多尔GF、越南和中国云南)的相应核苷酸序列相似性仅在58.1%~59.1%间。BSV不同分离物间最大的不同主要表现在基因组3’端,即ORF3和其后的非编码区长度明显不同,从而导致各分离物长度明显不同。BSV-OL 全长7389bp,而厄瓜多尔GF、越南(Vietnam)和中国云南(Yunnan)分离物的基因组长度依次分别为7263bp、7801bp和7722bp。BSV-GD与BSV-OL相比较,BSV-GD在编码区ORF3缺失369bp,在其后的非编码区又缺失70bp,共缺失439bp。 2.为了进一步提高香蕉胚性愈伤组织的诱导率,以我国种植的多个香蕉品种的未成熟雄花为外植体,探讨了接种部位、培养条件、培养容器及封口材料类型、培养基与pH值等因素对愈伤组织诱导的影响。结果表明:未成熟雄花顶端6~13排的雄花是最理想的接种部位,将外植体接种在透气性较好的培养容器中、培养在黑暗条件下能获得相对较高的愈伤组织诱导率;接种时期、品种、培养基成分与pH值等因素对愈伤组织诱导率产生一定的影响。 3.将‘巴西蕉’的未成熟雄花接种在MI培养基(MS+4 mg/L 2,4-D+1mg/LNAA+1 mg/LIAA+1 mg/L生物素+100 mg/L谷胺酰氨+100 mg·1<-1>麦芽抽提物+200 mg/L KH<,2>P04+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉,pH5.8)上进行愈伤组织的诱导,对愈伤组织诱导过程中的各个阶段进行组织学观察。结果表明:未成熟雄花外植体脱分化的起始部位在表皮下层的维管组织细胞,启动时间是在外植体接种后约4~5周;外植体接种8周后获得分生小球体;胚性愈伤组织形成于分生小球体的表面,胚性细胞具有大的细胞核、核仁比大、细胞质丰富。有时可以在在胚性愈伤组织表面观察到二分体和四分体,这表明香蕉体胚可能是单细胞起源的。 4.对未成熟雄花来源的胚性愈伤组织建立ECS的过程进行了详细的描述,并将非胚性细胞悬浮系(Non-embryogenic cell suspension,NECS)和ECS进行了比较。从外观上看,二者最大的区别是颜色,理想的ECS为黄白色,太黄或太白的就是NECS。从本质上二者最重要的区别是能否通过体细胞胚发生途径获得大量的再生植株,悬浮系的细胞增殖速率不能用于悬浮系胚性的判断。 5.为进一步提高体细胞胚发生途径植株再生过程中的植株再生能力,对影响ECS植株再生能力的几个因素进行了研究。结果表明:供试的3个香蕉品种的ECS,其植株再生力因品种、体细胞胚再生时的培养条件而异,从每毫克悬浮细胞获得的再生植株数为1.20×10<2>~5.57×10<4>株;悬浮系的质量也是影响体细胞胚萌发率的一个重要因素,同一‘巴西蕉’的2个ECS,其植株再生能力相差近10倍之多;体细胞胚再生时的培养条件对ECS的植株再生能力有重要影响,3个品种的ECS多数在光照条件下进行体细胞胚再生时,从每毫克细胞获得的再生植株数高于在黑暗条件下再生的。 6.构建了携带BSV ORF3基因片段的植物表达载体,然后通过根癌农杆菌介导法将其导入‘北大矮蕉’ECS中,进行遗传转化的初步探索。结果如下:1)初步建立了以香蕉ECS为受体系统的遗传转化体系;2)提出了以ECS为受体遗传转化效率的计算方法;3)共获得可能的转化植株20株,其中18个经PCR检测呈阳性。
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