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研究背景与目的硫氧还蛋白过氧化物酶家族最初发现于酵母中,构成了一个与既往的抗氧化蛋白无同源性的抗氧化物酶家族。目前从细菌到哺乳动物细胞中报道有一百多个具有高度保守蛋白结构域的同系物。硫氧还蛋白过氧化物酶家族在多种细胞功能中发挥重要作用,如抗氧化损伤保护蛋白和脂质,细胞增殖、分化,调节凋亡过程中细胞内信号传导等。增加细胞内抗氧化酶水平可抗凋亡。硫氧还蛋白过氧化物酶家族是红细胞中主要的抗氧还剂,并且介导早期红细胞系的分化。该家族所包含的一类过氧化物酶,能够利用其活性半胱氨酸残基清除过氧化物及羟基。根据氨基酸序列的差异,硫氧还蛋白过氧化物酶家族有六个亚型,并被分为两大亚家族。亚家族一含有两个保守性半胱氨酸残基,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个亚型,亚家族二拥有一个保守性半胱氨酸残基,包括Ⅴ和Ⅵ两个亚型。Ⅰ和Ⅱ亚型位于胞浆中。与细胞增殖、分化、抗凋亡及肿瘤相关。研究表明,硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在红细胞及K-562红白血病细胞系中作为巯基特异性的抗氧还剂。硫氧还蛋白过氧化物酶家族在某些肿瘤组织中高表达。硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在人乳腺癌组织中过表达,并与肿瘤的发展和分级相关。硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅰ在肺癌、甲状腺瘤及口腔肿瘤中也有高表达,是潜在的肿瘤标记物。硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ是酵母的硫氧还蛋白过氧化物酶的人类同源体,又名硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶Ⅰ(thioredoxin-dependent peroxide reductase 1 ,TDPX1)或自然杀伤增强因子B(natural killer-enhancing factor-B ,NEKF-B),位于染色体13q12,在人神经元细胞有表达,但在神经胶质细胞不表达。硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ可利用硫氧还蛋白作为直接的电子供体发挥降解过氧化氢及其他活性氧类物质的作用。其过氧化物酶活性能保护细胞免于活性氧的损伤。硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ因其对细胞内过氧化氢浓度调节作用,参与了生长因子和肿瘤坏死因子α的细胞内信号转导。目前研究表明,硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ具有硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶活性,能够抑制细胞凋亡,与细胞膜结合,与红细胞中钙离子激活的钾离子转运相关。在既往的研究中,我们发现在皮肤组织中至少有三种硫氧还蛋白过氧化物酶亚型存在,而硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ主要存在于真皮层的上皮细胞及其附属结构中(毛囊、汗腺及皮脂腺中),我们还发现,硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ存在于正常皮肤的血管内皮细胞中。硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ存在于红细胞及人脐内皮细胞的胞浆中,同时表达于人体表皮肤的良恶性血管瘤。因其高表达于血管内的红细胞中,甚至可作为检测组织样本中的血管标记物。硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ不仅能发挥抗氧化应激的细胞保护作用,同时赋予肿瘤细胞抗过氧化氢、顺铂和抗辐射的能力。硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ可在过氧化氢及顺铂的作用下表达上调,并能抑制顺铂、促甲状腺激素、血浆剥夺、神经酰胺及鬼臼乙叉甙引起的细胞凋亡,因此硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的过表达可导致化疗耐药。研究表明,硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ还能介导辐射抵抗。在既往的研究中,我们通过二维电泳和质谱分析发现Prx II蛋白在高转移潜能的肿瘤细胞系PC-3M-1E8的表达水平较低转移潜能的肿瘤细胞系PC-3M-2B4明显下调。为了研究前列腺癌的分子机制,阐明Prx II基因和前列腺癌的相关性,我们对Prx II基因进行了深入的研究。基于Prx II基因在不同转移潜能的前列腺癌细胞中存在表达异常和功能障碍,通过药物或者遗传修饰等手段控制Prx II基因的功能或它们的调节通路,将是一个令人振奋但又出人意料的分子治疗靶点。方法运用RT-PCR、免疫细胞化学及Western blot法检测配对高低转移前列腺癌细胞系中Prx II mRNA及蛋白的表达水平;采用基因工程技术构建Prx II全长真核表达载体,G418筛选稳定表达Prx II的前列腺癌细胞克隆株;应用RT-PCR、cfse-流式细胞测定和体外细胞迁移实验等方法观察1E8/Prx II细胞增殖及其运动能力的变化;应用RT-PCR、Western blot法检测1E8/Prx II细胞和1E8/pcDNA3.1细胞中AKT、P-AKT、E-cadherin、β-catenin和Bcl-X/L的表达变化;采用细胞迁移实验、Transwell体外侵袭实验和细胞黏附实验检测1E8/Prx II细胞和1E8/pcDNA3.1细胞的增殖、细胞运动、体外侵袭和黏附能力。另外,为了筛选在前列腺癌细胞中与PrxⅡ蛋白相互作用的蛋白,我们应用酵母双杂交体系,构建人PrxⅡ蛋白酵母双杂交诱饵载体,将该基因片段与pGBKT7载体定向重组,将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果1. Prx II mRNA和蛋白水平在高转移潜能的前列腺癌细胞系PC-3M-1E8的表达水平较低转移潜能的前列腺癌细胞系PC-3M-2B4明显下调,表明Prx II基因的异常表达与肿瘤转移密切相关,2.成功构建了Prx II基因的全长真核表达载体,获得稳定表达Prx II的前列腺癌细胞克隆株1E8/Prx II和转染空载体pcDNA3.1的对照细胞克隆株1E8/pcDNA3.1。3.通过转染技术使人前列腺癌PC-3M-1E8细胞过表达Prx II,能够抑制细胞体外增殖、运动和侵袭能力,同时,Prx II的过表达促进丁基过氧化氢(TBHP)引起的前列腺癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,可能是通过下调PI4K/AKT胞内信号对PC-3M-1E8细胞发挥作用的。4.过表达外源性Prx II,通过使AKT失活、调控内化的E-cadherin的再循环,增加E-cadherin/catenin复合物形成,改变了细胞极性和组织结构,抑制人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的转移表型。5.成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His /-Trp /X-α-gal, SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上不能生长,并将pGBKT7-PrxⅡ诱饵质粒成功转化入酵母菌AH109,且对酵母菌株AH109无毒性,不具自主激活报告基因的功能。结论验证PrxⅡ在不同高低转移配对前列腺癌细胞株的表达显示,PrxⅡ基因的异常表达与肿瘤转移密切相关,使人前列腺癌PC-3M-1E8细胞过表达Prx II,能够抑制细胞体外增殖、运动和侵袭能力,同时,Prx II的过表达促进丁基过氧化氢(TBHP)引起的前列腺癌细胞凋亡,抑制细胞增殖。进一步探讨PrxⅡ基因参与前列腺癌侵袭转移的分子机制发现:外源性PrxⅡ过表达,下调PI4K/AKT胞内信号,抑制人前列腺癌PC-3M-1E8细胞的体外增殖和运动能力;PrxⅡ的过表达抑制AKT活化,调控内化的E-cadherin的再循环,从而改变E-cadherin/catenin复合物维持细胞极性和组织结构的功能,抑制人前列腺癌PC-3M-1E8细胞的转移表型,PrxⅡ的过度表达逆转前列腺癌细胞的转移表型。另外,成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。