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背景:银屑病(Psoriasis)是常见的一种慢性炎症性皮肤病,临床以鳞屑性红斑或斑块为主要表现,其中寻常型银屑病是其最为多见的临床类型。银屑病病情顽固,易于反复,由于其确切的病因及发病机制尚不完全清楚,临床缺乏针对性的治疗手段。目前研究表明T细胞介导的免疫紊乱、角质形成细胞的过度增殖和角蛋白谱表达异常是银屑病发病的关键环节。角蛋白17(Keratin 17,K17)是银屑病表皮角质形成细胞特异性高表达的角蛋白,主要通过促进角质形成细胞增殖、诱导炎性介质释放、刺激T细胞活化等方式参与疾病发生,被认为是银屑病角质形成细胞增殖活跃的主要标志。阿维A是中重度寻常型斑块状银屑病的一线治疗药物,虽疗效肯定,但潜在的肝损害等不良反应却不容忽视。中医中药在我国银屑病的治疗中发挥了独特的作用,尤其在提高疗效、减少复发、降低副反应及经济实用等方面显现出独特的优势,然而,因中医药的临床应用缺乏规范的循证医学证据,加之中药或其有效成分治疗银屑病的作用机制不清楚,成为限制其进一步发展和广泛应用的主要障碍。白芍总苷(Total glucosides of paeonia,TGP)是从中药白芍中提取的有效成分,芍药苷(Paeoniflorin,PF)是其中最主要的活性成分,具有抗炎、止痛、保肝、调节免疫以及影响细胞增殖等多种药理作用,被皮肤科医生尝试用于银屑病、特应性皮炎等免疫相关的慢性炎症性皮肤病的治疗,目前已有病例或医者经验报道芍药苷治疗银屑病有效,但其治疗的有效性及安全性缺乏规范的临床研究数据支撑,极大限制了芍药苷在银屑病等慢性炎症性皮肤病治疗中的应用和发展。对芍药苷治疗银屑病的作用机理研究发现,其可通过抑制炎症细胞浸润、抑制炎症因子及抑制血管新生发挥治疗作用。然而,银屑病的发生发展与角质形成细胞的活化和生物学功能改变密切相关,芍药苷是否可直接作用于角质形成细胞而发挥治疗作用?对于与角质形成细胞增殖密切相关的角蛋白是否具有影响?其具体调控机制又是什么?尚无报道,仍有待于深入研究探讨。为充分证实芍药苷对银屑病的临床疗效,本课题第一部分设计了规范的随机对照临床研究,评价其治疗寻常型斑块状银屑病的有效性及安全性;同时,基于对角蛋白17高表达促进角质形成细胞增殖活跃的重要认识,本课题第二部分以“芍药苷抑制角蛋白17表达影响角质形成细胞增殖”的研究假说为切入点,进一步探讨芍药苷治疗银屑病的作用机制。目的:1、通过多中心、随机、双盲、平行对照临床研究,证实芍药苷治疗寻常型斑块状银屑病的有效性及安全性;2、通过体外细胞实验和动物实验,明确芍药苷通过抑制K17表达调控角质形成细胞增殖和炎症因子分泌,从而治疗银屑病的作用机制。方法:1、临床研究:评价芍药苷治疗寻常型斑块状银屑病的有效性及安全性。采用多中心、随机、双盲、平行对照的研究设计,选择国内3家临床研究中心,纳入18-65岁符合临床诊断明确的中重度寻常型斑块状银屑病门诊患者,按照1:1的比例随机分为试验组和对照组,试验组接受口服白芍总苷胶囊及阿维A胶囊治疗,对照组接受口服阿维A胶囊和白芍总苷胶囊模拟剂治疗。治疗12周后,通过比较两组银屑病皮疹面积和严重程度(PASI)评分的改善达到50%(PASI50)、75%(PASI75)及90%(PASI90)的患者比例,评价芍药苷治疗寻常型斑块状银屑病的有效性;通过收集不良事件的发生情况及比较治疗前后各项检查,尤其是肝功能指标(谷丙转氨酶及谷草转氨酶)的数值变化,评估芍药苷治疗寻常型斑块状银屑病的安全性。2、体外细胞实验:观察芍药苷调控K17表达对角质形成细胞增殖的影响及其机制。利用四联细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-17和IL-23)刺激角质形成细胞系HaCat构建银屑病样细胞模型,加入不同浓度的芍药苷(75-1200 ug/ml)进行干预。首先采用CCK-8检测芍药苷干预0、24和48小时后对HaCat细胞增殖活力的影响,随后通过Real-time PCR、Western Blot及免疫荧光等方法研究明确PF是否通过下调银屑病相关角蛋白6、16、17来抑制角质形成细胞增殖。根据上述筛选的芍药苷最佳浓度和作用时间处理HaCat细胞,采用Western Blot方法对银屑病以及K17相关的炎症通路进行筛选(包括STAT1、STAT3、ERK、NF-kB等激酶水平),免疫荧光测定相关核转录因子的转位变化情况;随后利用相应的通路抑制剂进行干预,明确PF调控K17表达的信号通路。3、动物实验:观察芍药苷外用对咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病样皮损及表皮K17表达的影响。构建IMQ诱导的银屑病样小鼠模型,对小鼠背部剃毛之后上午涂抹咪喹莫特造模,下午涂抹芍药苷进行治疗,治疗7天后观察IMQ诱导的小鼠红斑、鳞屑等银屑病样表型的变化,HE染色观察皮损病理改变,Real-time PCR、Western Blot及免疫荧光方法观察芍药苷对银屑病表皮炎症因子及K17表达的影响,明确芍药苷外用治疗银屑病的临床有效性。结果:1、临床研究结果:3家研究中心共计入组中重度寻常型斑块状银屑病受试者108例,研究结束时,共84例受试者完成全部访视,纳入有效性分析;共97例受试者接受药物治疗且具有至少一次用药后血生化检测报告,纳入安全性分析。1)PASI评分改善情况:治疗组PASI50的改善明显优于对照组。治疗12周后与基线期比较,试验组PASI评分的改善情况优于对照组,具体表现为:试验组患者40例,达到PASI50、75、90改善的比例分别为90%、52.5%及12.5%;对照组44例,达到PASI50、75、90改善的比例分别为70.5%、40.9%以及9.1%。经卡方检验,达到PASI50改善的比例两组间差异有统计学意义(P<0.05),PASI75及PASI90改善的比例两组间差异无统计学意义。2)肝功变化等不良反应:治疗组肝功能损害的发生率低于对照组。与基线期比较,试验组48例,发生ALT升高的患者为3例,肝损害发生率为6.25%。对照组49例,发生ALT升高的受试者为10例,肝损害发生率为20.4%。两组AST升高均不明显。经卡方检验,两组总肝损发生率的比较有统计学差异(P<0.05)。其他不良反应方面,两组受试者共发生甘油三酯升高23例,总胆固醇升高4例,口干14例,皮肤干燥、瘙痒、脱屑6例,脱发2例,腹泻6例,组间对比均无统计学差异。2、体外细胞试验:芍药苷通过影响NF-kB的磷酸化调控K17表达抑制角质形成细胞增殖。1)芍药苷可以抑制HaCat的增殖:在四联细胞因子刺激的银屑病样细胞模型中加入不同浓度PF(75-1200 ug/ml)进行干预,结果显示在PF干预48后,PF能够以剂量依赖的方式抑制四联细胞因子诱导的角质形成细胞增殖。2)芍药苷可以抑制HaCat中K17的表达:Real-time PCR、Western Blot及免疫荧光结果显示,PF能够以剂量依赖的方式抑制银屑病样细胞模型中K17的表达。3)芍药苷通过影响NF-kB的磷酸化调控角质形成细胞K17表达:通过Western Blot筛选炎症相关通路,发现NF-kB通路的磷酸化在芍药苷干预后受到了抑制。同时,在银屑病细胞模型加入NF-kB的抑制剂,发现抑制NF-kB信号通路可明显抑制K17的表达。进一步通过设置时间梯度发现,处理2h后NF-kB和IkBa的磷酸化水平达到最低,K17的表达也随之降低,提示芍药苷可能通过影响NF-kB和IkBα的磷酸化调控角质形成细胞K17表达。3、动物实验:外用芍药苷可缓解咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病样表型,抑制表皮K17的表达。1)外用芍药苷可以缓解IMQ诱导的小鼠银屑病样表型:IMQ处理组的小鼠,背部的红斑和鳞屑明显增多,而外用芍药苷的小鼠其银屑病表型得到了明显的缓解,红斑变淡、鳞屑减少。2)外用芍药苷可以抑制IMQ诱导的银屑病小鼠表皮增厚:小鼠背部组织病理切片HE染色结果显示,相比于IMQ处理组,外用芍药苷的小鼠表皮明显变薄。3)外用芍药苷可以减少IMQ诱导的银屑病小鼠表皮炎细胞浸润并下调炎症因子的表达:免疫荧光结果显示,外用芍药苷能显著地减少银屑病小鼠表皮中性粒细胞的浸润,进一步通过RT-PCR检测发现外用芍药苷组其小鼠表皮炎症因子的表达有下调的趋势,其中,对IL-17和IL-22的下调作用最为明显,具有统计学差异(P<0.05)。4)外用芍药苷可以抑制IMQ诱导的银屑病小鼠表皮K17的表达:对银屑病小鼠表皮组织K17的表达进行检测,Real-time PCR、Western Blot和免疫荧光结果显示,外用芍药苷的小鼠表皮组织K17的表达受到了明显的抑制。结论:本课题研究首先通过科学、规范的临床研究证实:白芍总苷联合阿维A治疗中重度寻常型斑块状银屑病,可更有效地缓解银屑病临床症状,发挥协同提高疗效的作用,同时联合治疗可降低阿维A治疗引起的肝损害发生率,更适合于银屑病的长期临床应用。对芍药苷治疗银屑病的作用机理研究证实:芍药苷可以通过NF-kB通路抑制K17表达,抑制角质形成细胞增殖,影响银屑病异常免疫应答,发挥其治疗作用。同时,动物实验发现芍药苷外用能明显改善动物模型银屑病红斑、鳞屑的皮损表现,更提示芍药苷具有外用治疗银屑病的潜在优势,为芍药苷治疗银屑病提供了新的治疗策略,为进一步开发及应用芍药苷作为银屑病的外用治疗药物奠定了理论基础。