论文部分内容阅读
海绵是一种古老的生物，属于多孔动物门，其体内含有异常丰富和结构独特的天然产物，是最大的海洋活性代谢产物和最大的新药候选分子来源。但由于海绵天然产物的含量非常低，同时缺乏经济有效的化学合成途径来人工合成这些天然产物，使得进一步研究或开发这些海绵中的活性产物变得十分困难。海绵作为滤食型多细胞动物，主要靠过滤海水摄食，体内富集了大量的微生物，其重量能占到海绵自身的40％。现在，越来越多的证据表明海绵活性物质真正的来源是海绵共附生的微生物，其中这些微生物绝大多数在目前是不可培养的。因此，对海绵共附生微生物的研究不仅能确定海绵活性物质的真正来源，解决海绵来源药物的药源问题，而且能深入地了解海绵和共附生微生物之间的相互关系以及它们在整个生态系统中扮演的角色。
宏基因组方法是近年来发展起来的分子生物学方法。它不依赖于培养技术就能挖掘和利用未培养微生物资源，在筛选新颖生物活性物质方面具有极大的应用潜力。大片段DNA插入子文库不仅便于测序细菌基因组的重组，而且是利用宏基因组方法筛选活性化合物的重要前提。
本文以汕头海域普遍存在的海绵Halichondria sp.为主要研究材料，结合多种分子生物学手段，从不同角度来研究海绵共附生微生物。首先，利用分子生物学方法对从海绵Halichondria sp.中可培养放线菌及其天然产物多样性进行研究。利用传统的细菌分离培养技术，本研究从海绵Halichondria sp.分离得到了36株放线菌。初步鉴定这些放线菌属于2个属的9个种，其中1个种属于拟诺卡氏菌属，剩下的8个种都是链酶菌。分子生物学方法筛选显示绝大多数的菌株都含有化合物PKSI，PKSII，NRPS或angucycline的基因，其中2个菌株(Streptomycetaceaesp. 4MN1和15MN1)同时含有以上四种基因。结果表明海绵Halichondria sp.中的放线菌的天然产物多样性丰富，盛产活性产物。另外，抑菌实验表明几乎所有的放线菌都有抑制Staphylococcus aureus的抗菌活性，其中Streptomycetaceae sp4MN1同时还表现对Bacillus subtilis和Escherichia coli有抑菌活性。这进一步验证了分离得到的放线菌具有丰富的天然产物，是研究微生物天然产物的重要材料，也是药物开发的重要资源。
针对目前因化合物高重复发现率制约微生物天然产物开发的现象，本论文系统分析了芳香族聚酮类的环化酶特征后，开发了一种新的分子生物学方法来快速筛选产angucycline(角环素)的放线菌，更加细化地评价微生物天然产物的多样性。并利用此方法对来源于中国南海海域包括底泥和海绵放线菌在内的69个样品进行分析，结果显示angucycline基因广泛存在于中国南海海洋环境。对克隆得到的angucyline环化酶测序结果表明海洋环境样品中环化酶基因多样性丰富，其中多种类型是新的环化酶基因。这意味着angucycline类的化合物广泛存在于中国南海海洋环境中，并且多样性丰富，其中还有许多新类型此类化合物没有被发现。另外，在深海底泥、海绵附生菌(Streptomycessp.4MN1)以及土壤样品中共同存在着同一种类型的angucycline环化酶基因(EU784090)。为研究此类型环化酶的产物及其作用，本论文还构建了海绵附生菌(Streptomycessp.4MN1)的BAC文库，并从中筛选到此了含此环化酶基因(EU784090)的克隆子，为今后的进一步研究奠定了基础。
接着本研究还开发了一种提取海绵共附生微生物大片段DNA的方法，建立了大片段DNA插入子的海绵BAC宏基因组平台，以用于开发和研究海绵未培养的共附生微生物。本研究应用大片段DNA提取方法从中国南海的多种海绵(Halichondria sp.，Haliclona sp.和Xestospongia)中分离得到了超过400 kb的DNA片段，并结合16S rDNA技术分析了海绵Halichondria sp.共附生微生物的多样性。结果表明海绵Halichondria sp.体内微生物多样性丰富，并且大部分细菌是不可培养的。其优势种群为Alpha-、Beta-，Delta- Proteobacteria，Nitrospirae，Cyanobacteria，Planctomycetes，以及一类未知的细菌。Planctomycetes序列的获得，不仅从侧面验证了本研究开发的DNA提取方法适合提取海绵细胞内共附生微生物，同时也证实了海绵中大量存在Planctomycetes细菌，此类细菌在海绵中的作用目前被忽视，值得进一步研究。本论文利用分离得到的大片段DNA和穿梭载体pBAC-1003，首次构建了海绵Halichondria sp.的BAC宏基因组穿梭文库，平均插入片段在100kb左右。虽然fosmid文库比较普遍的用于各种环境的宏基因组文库构建，但由于有插入DNA片段小等明显的缺点成功筛选出化合物的例子很少。而本研究构建的平均插入片段在100kb的BAC文库至少在理论上能满足宏基因组文库用于活性化合物的筛选以及其基因簇分离的要求，同时穿梭载体的应用也提供了一种有效的途径以利用异源表达海绵未培养细菌的基因资源来进行药物开发。
综上所述，本论文以海绵Halichondria sp.为研究材料，利用几种分子生物学方法对海绵共附生微生物进行了研究和探讨，建立了宏基因开发未培养微生物资源的平台，开发了新体系来评价微生物天然产物的多样性，为更加深入的研究奠定了基础。