论文部分内容阅读
酰胺酶(Amidase,EC3.5.1.4)是一类催化酰胺类底物水解成自由羧酸并产生游离氨的水解酶。鉴于多种酰胺和羧酸及其衍生物是合成多种药物的重要中间体,酰胺酶在药物合成化学和精细化工上的应用越来越广。本研究主要针对红球菌Rhodococcus erythropolis AJ270酰胺酶进行了以下几个方面的研究。
采用超声破碎、硫酸铵分级沉淀、两次离子交换柱层析、分子筛层析、天然胶电泳回收的方法,将酰胺酶从红球菌R.erythropolis AJ270的发酵液中分离纯化出来,得到了纯度大于95％的酶蛋白,收率为11.8%。活性酶蛋白为同源二聚体,分子量110kDa。最适反应温度40℃,最适Ph值7.5。Cu2+、Hg2+、Pb2+等重金属离子对酰胺酶具有强烈抑制作用。
将红球菌R.erythropolis AJ270的酰胺酶基因插入表达载体pET22b中,并在E coli BL21(DE3)中得到活性表达。蛋白表达具有温度依赖性,诱导温度在25℃时所表达酶活性最高。采用经本研究改进的CAIM3自诱导培养基,不但简化了发酵操作程序,还使发酵液的酶活性由LB培养基中的2.54U/ml提高到22U/ml,细胞裂解液的比活达到3.71U/mg蛋白,这在目前的报道中是最高的。采用Ni-NTA亲和层析将酰胺酶从细胞裂解液中纯化出来,纯度达到95%以上。纯化后的酶蛋白以乙酰胺为底物时Km和Vmax值分别为4.12mM和6.89 umol/min/mg蛋白。该酶具有良好的热稳定性。立体专一性水解实验表明,作用于不同的消旋化酰胺时,该酶对于α位取代的消旋酰胺,有严格的(S)-对映选择性;对β-氧苄基和β-氨苄基取代的酰胺也有很高的(S)-对映选择性,这在手性合成方面具有良好的应用前景。但是该酶对含有β.羟基和β-氨基取代的酰胺,对映选择性却很差。另外,对含有不饱和侧链的酰胺也有一定程度的对映选择性。
采用EMS和NTG对酰胺酶基因进行化学诱变,经过筛选得到了一株突变株,其发酵液酶活提高了5倍;定点突变证实该突变酶酶活升高是因为发生Y217S突变所致。通过同源建模及对酶蛋白的结构分析得知,该酶的217位氨基酸残基处于底物进出酶活性中心的通道上,Y217S突变有利于酶的底物和产物进出活性中心,从而显著增加酶的活性。另外采用定点突变的方法对该酶进行分子改造,证明该酶不仅具有Ser171-cisSer195-Lys96酰胺水解酶的三联体的活性中心,同时还有潜在的腈水解酶Ser171-Cys145-Lys96三联体催化中心。当发生K96R突变后,腈水解酶活性显著增加。
此外,还探讨了离子液体对酰胺酶活性的影响。结果显示50%的离子液体[BMIm][PF6]对酰胺酶活性有明显的促进作用,跟水相相比活力提高到1.5倍左右,并且能增加酰胺酶的热稳定性,其中50℃4小时处理后残留酶活比对照提高37%。而离子液体[BMIIn][BF4]则对酰胺酶有明显的抑制作用。