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犬瘟热病是由犬瘟热病毒(CDV)感染犬和其他食肉动物的多发性、致死性传染病。CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属，为有囊膜的负链线性RNA病毒，基因组长约16kb。基因组中包括6个非重叠基因区。它们的编码基因按3′～5′端顺序依次为N-P-M-F-H-L系列。最新研究表明CDV融合蛋白(F)和血凝素(H)蛋白是宿主免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原之一。核衣壳(N)蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白，此外N蛋白上含有T细胞表位。H，F和N蛋白在犬瘟热的免疫预防方面起重要作用。 本研究旨在获得CDV的N，F和H蛋白基因，将其克隆后在大肠杆菌中表达，获得大量易于纯化的N，F和H蛋白并对其功能进行研究，为研制基因工程疫苗和诊断试剂等打下理论基础。 一、CDV N基因保守区序列(NC)的克隆及表达：从犬瘟热病毒Onderstepoort株中提取病毒RNA，经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得犬瘟热病毒全长N基因，然后应用2对引物扩增获得2段CDV编码N蛋白保守区基因(NC1和NC2)，将此片段克隆到质粒pGEM-Teasy测序，测序结果显示NC1和NC2与CDV Onderstepoort株DNA和推导的氨基酸同源性分别为99.7％、99.3％和100％、100％，利用谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX-5x-3和麦芽糖结合蛋白(MBP)融合表达载体pMAl-C2构建了重组表达载体pGEX-5x-3-NC2和pMAl-C2-NC1，重组表达质粒经PCR和酶切鉴定后，将其分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)plys中和DH5α细胞中，经IPTG诱导，pGEX-5x-3-NC2没有获得目的蛋白表达，而pMAl-C2-Nc1成功获得了目的蛋白表达。 二、CDV H基因的克隆及表达尝试：应用一对引物，经RT-PCR扩增获得CDV全长H基因，将此片段克隆到pGEM-Teasy测序，测序结果显示与CDV Onderstepoort株DNA同源性为98.8％，所编码的氨基酸同源性为98.2％。然后利用6×His标记的重组表达载体pQE-32构建了重组原核表达载体pQE-32-H，重组表达质粒经PCR和酶切鉴定后，转化到大肠杆菌M15中，经IPTG诱导，没有获得目的蛋白的表达。 三、CDV F基因的克隆和表达：应用一对引物，经RT-PCR扩增获得CDV全长F基因，以全长F基因为模板应用4对引物，通过重叠PCR(OE-PCR)扩增获得缺失疏水区的F基因(dF)。将此片段克隆到质粒pGEM-Teasy测序，测序结果显示，与CDVOnderstepoort株DNA同源性为99.2％，所编码的氨基酸同源性为98.4％。将此片段插入 中文摘要到pQE一30质粒构建了重组pQE一30一dF原核表达质粒，重组表达质粒经PCR和酶切鉴定后，转化到大肠杆菌M巧细胞中，经IPTG诱导，获得了目的基因的高效表达，经聚丙烯酞胺凝胶电泳和W己stem一印迹试验，验证其表达的重组蛋白产物分子质量大小为预期的47000。将表达产物用Ni一NTA琼脂糖进行纯化，获得较高纯度的目的蛋白，目的蛋白进行复性后免疫小鼠，所得的抗血清与CDV感染的Vero细胞在免疫荧光试验(IFA)中，呈细胞阳性染色。 四、CDVF蛋白的应用:以重组表达的F蛋白作为包被抗原，初步建立了检测犬瘟热血清抗体的间接ELIsA方法。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为125n留孔，血清最佳稀释度为1:160。经阻断试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性较好，可用于犬瘟热血清抗体的定量和定性检测。