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在哺乳动物基因组中,存在着大量具有低蛋白表达能力的RNA长转录本—长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNAs),它的长度一般在200 nt以上,具有相对保守的二级结构、一定的亚细胞定位和剪接形式,其种类、数量及作用机制尚不完全明确。lncRNAs在宿主与病毒博弈过程中广泛存在,Yin等通过全转录本测序发现SARS冠状病毒感染的小鼠体内、IAV感染的人肺上皮细胞中和EV71感染的RD细胞中均存在差异表达的长链非编码RNA。其中有些病毒可以通过与lncRNAs相互作用来调节宿主和/或病毒的基因表达,从而影响病毒自身的潜伏或复制;有些lncRNAs能够协助病毒复制,帮助其逃离免疫监视,抑制抗病毒免疫。由此可见lnc RNAs在病毒感染及抗病毒免疫中发挥着重要作用。然而,在病毒感染疾病中只有部分lncRNAs的功能得到了详细研究。呼吸道合胞病毒(RSV)是有包膜的单股负链RNA病毒,是引起婴幼儿呼吸道病毒感染的重要病原体之一;在RSV引起的上呼吸道感染中,25~40%会合并更为严重的下呼吸道感染,导致毛细支气管炎或肺炎。那么在RSV与宿主细胞博弈过程中是否有lncRNAs的参与呢?我们在Johnmattick构建的lncRNAdb数据库中检索到了4条与RNA病毒或呼吸道病毒感染有关的lnc RNAs,包括NEAT1,PRINS,NEST和NRAV。通过RSV感染验证实验,发现只有长链非编码RNA NRAV的表达量与假感染组有差异。有关NRAV表达与病毒感染之关系,欧阳晶等曾发现在甲型流感病毒、仙台病毒、呼肠孤病毒和单纯疱疹病毒感染呼吸道上皮细胞时NRAV表达下调,并且NRAV能够通过抑制细胞ISG基因转录促进病毒复制。长链非编码RNA功能广泛,可以在DNA、RNA或蛋白质水平上分别或同时发挥调节作用。其调控机制之一—竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)表明,细胞内存在着一种以miRNA为枢纽的转录后调控网络,如果lncRNAs和蛋白质编码基因的mRNA可以共享相同的miRNA反应原件(MRE),lncRNAs就可以通过结合miRNA,起到对mirna控制的下游靶基因表达增强或减弱的间接调控作用,故也将具有cerna作用的lncrnas称为“分子海绵”。考虑到lnc-nrav在细胞中的定位主要是细胞浆,而胞浆也是成熟mirna的分布区域,在本研究中,我们以呼吸道上皮细胞a549和beas-2b细胞作为rsv的感染模型,以胞浆lnc-nrav及其调控的下游mirna、靶基因为研究对象,深入探讨了lnc-nrav对rsv感染的影响,进一步丰富了对lncrnas与呼吸道感染病毒相互关系的了解。第一部分rsv感染对呼吸道上皮细胞lnc-nrav表达的影响及lnc-nrav对病毒增殖的调节作用目的:通过qrt-pcr验证rsv感染细胞长链非编码rnaneat1、prins、nest和nrav的表达情况;利用生物信息学手段,了解长链rnanrav的蛋白质编码能力和序列保守性;通过qrt-pcr,探讨rsv感染对a549和beas-2b细胞lnc-nrav表达的影响;通过敲低或过表达细胞中lnc-nrav的表达量,探讨lnc-nrav对病毒增殖可能的影响。方法:1rsv(moi=3)感染a549细胞后12h、24h、36h,qrt-pcr检测长链非编码rnaneat1、prins、nest和nrav的表达情况。2根据上一步的检测结果,只有长链rnanrav在rsv感染的a549细胞中有表达变化。故使用lncipedia、ucsc数据库分析长链rnanrav的蛋白质编码能力、二级结构和序列保守性。3以感染复数moi=3的rsv病毒感染a549或beas-2b细胞28h,每2h收取一次细胞总rna,qrt-pcr检测lnc-nrav表达量。4在过表达lnc-nrav的细胞中感染rsv,感染后第4~28h每4h收取一次细胞总rna,qrt-pcr检测rsvns1、n、f、g、m、m2基因的相对表达量;在感染后第24h、48h、72h收取细胞总蛋白,westernblot检测rsvf蛋白的表达量;在感染后第24~48h每4h收取一次细胞上清,病毒空斑试验检测细胞上清中rsv病毒滴度的变化情况。5在敲低lnc-nrav的细胞中感染rsv,在感染后第4~28h每4h收取细胞总rna,qrt-pcr检测rsv相关基因的相对表达量;在感染后第24h、48h、72h收取细胞总蛋白,westernblot检测rsvf蛋白的表达量;在感染后第24h~48h每4h收取一次细胞上清,病毒空斑试验检测细胞上清中rsv病毒滴度的变化情况。结果:1lnc-nrav在rsv感染a549(moi=3)第24h、36h表达下降(p<0.05);lncrnaneat1、prins、nest的表达无明显变化(p>0.05)。2lnc-nrav不具备编码蛋白质的功能,具有由多个茎环结构组成的二级结构,与小鼠等其他脊椎动物同源性较低。3rsv感染a54920h后,lnc-nrav的表达量逐渐下降(p<0.05);rsv感染beas-2b8h后,lnc-nrav的表达量逐渐下降(p<0.05)。4在细胞中,上调lnc-nrav的表达能够促进rsv的复制。在过表达lnc-nrav的细胞中感染rsv,rsv相关基因的相对表达量明显高于对照组(p<0.05),rsvf蛋白表达量明显高于对照组(p<0.05),细胞上清中rsv病毒滴度高于对照组(p<0.05)。5在细胞中,下调lnc-nrav的含量能够抑制rsv的复制。在敲低lnc-nrav的细胞中感染rsv,rsv相关基因的表达量明显低于对照组(p<0.05);rsvf蛋白表达量明显低于对照组(p<0.05);细胞上清中rsv病毒滴度低于对照组(p<0.05)。第二部分lnc-nrav结合mir-125a/b-5p的预测及验证目的:利用生物信息学手段,预测lnc-nrav是否具有结合mirna的潜力;通过双荧光素酶报告试验、过表达lnc-nrav或lnc-nravmut及回复试验,验证在呼吸道上皮细胞中lnc-nrav通过不完全互补配对结合mirna的可能性。方法:1使用mirdb数据库预测lnc-nrav结合mirna的潜力。2将野生型lnc-nrav序列插入双荧光素酶报告载体pmirglo的多克隆位点,构建双荧光素酶报告质粒pmirglo-nrav。将突变型lnc-nrav序列插入pmirglo的多克隆位点,构建双荧光素酶报告质粒pmirglo-nravmut。在a549或beas-2b细胞中,将pmir-glo、pmir-glo-nrav或pmir-glo-nravmut与mir-125mimics共转染,通过双荧光素酶报告试验检测lnc-nrav通过不完全互补配对结合mirna的可能性。3在细胞中过表达或敲低mir-125a/b-5p,检测lnc-nrav的表达量。4构建突变型lnc-nrav过表达质粒pcdna3.1-nravmut。在a549或beas-2b细胞中过表达野生型或突变型lnc-nrav,检测细胞中游离mir-125a-5p与mir-125b-5p的含量。5在细胞中过表达lnc-nrav、lnc-nravmut,或过表达lnc-nrav的同时过表达mir-125a/b-5p,rsv感染后48h收取细胞总rna,经qrt-pcr检测rsv相关基因的相对表达量;收取细胞总蛋白,westernblot检测rsvf蛋白的表达量;收取细胞上清,病毒空斑试验检测细胞上清中rsv病毒滴度的变化情况。6在细胞中敲低lnc-nrav,或敲低lnc-nrav的同时敲低mir-125a/b-5p,rsv感染后48h收取细胞总rna,经qrt-pcr检测rsv相关基因的相对表达量;收取细胞总蛋白,westernblot检测rsvf蛋白的表达量;收取细胞上清,病毒空斑试验检测细胞上清中rsv病毒滴度的变化情况。结果:1在a549或beas-2b中,lnc-nrav可以通过不完全互补配对结合mir-125a/b-5p。2在细胞中过表达或敲低mir-125a/b-5p,lnc-nrav的表达量与对照组相比无明显变化(p>0.05)。3过表达野生型lnc-nrav,细胞中游离mir-125a-5p与mir-125b-5p的含量下降(p<0.05),促进病毒复制。过表达突变型lnc-nrav,mir-125a-5p与mir-125b-5p含量与对照组相比无明显变化(p>0.05),对病毒复制无影响。4过表达lnc-nrav的同时过表达mir-125a/b-5p,或者在敲低lnc-nrav的同时敲低mir-125a/b-5p,会使呼吸道上皮细胞中rsv产量回复到对照组水平。第三部分lnc-nrav间接调控的cerna环路靶mrna的预测及验证目的:利用生物信息学手段,预测mir-125a/b-5p可能的靶基因,通过双荧光素酶报告试验验证预测结果;在rsv感染的呼吸道上皮细胞a549或beas-2b中,验证lnc-nrav与mir-125参与的cerna环路中的可能靶mrna。方法:1利用targetscan、mirdb和microrna三个生物信息学数据库共同预测mir-125a-5p、mir-125b-5p的靶基因,根据预测结果的交集选择可能的靶mrna。根据预测结果,mir-125a/b-5p可能的靶基因有il-6r、irf4、il-31、cd5l、il-16、cxcl13。通过qrt-pcr检测了a549和beas-2b细胞中以上预测基因的表达量,因结果提示,只有il6-r在a549和beas-2b细胞中有表达,故后续试验围绕il-6r设计进行。2构建双荧光素酶报告质粒pmirglo-il-6r。在细胞中转染pmirglo-il-6r的同时分别共转染pcdna3.1、pcdna3.1-nrav或pcdna3.1-nravmut,在回复试验中共转染pmirglo-il-6r与pcdna3.1-nrav的同时转染mir-125amimics或mir-125bmimics,检测各组荧光素酶的表达量。3在细胞中转染pmirglo-il-6r的同时敲低lnc-nrav,在回复试验中共转染pmirglo-il-6r与si-nrav的同时转染mir-125ainhibitor或mir-125binhibitor,检测各组荧光素酶的表达量。4过表达lnc-nrav、lnc-nravmut,或过表达lnc-nrav的同时过表达mir-125a/b-5p,收取细胞总rna,通过qrt-pcr检测各组il-6r相对表达量;收取细胞总蛋白,westernblot测各组il-6r的表达量。5敲低lnc-nrav或敲低lnc-nrav的同时敲低mir-125a/b-5p,收取细胞总rna,通过qrt-pcr检测各组il-6r相对表达量;收取细胞总蛋白,westernblot测各组il-6r的表达量。6过表达mir-125a/b-5p或过表达mir-125a/b-5p的同时过表达lnc-nrav,收取细胞总rna,通过qrt-pcr检测各组il-6r相对表达量;收取细胞总蛋白,westernblot测各组il-6r的表达量。7过表达lnc-nrav、lnc-nravmut、il-6r或过表达lnc-nrav、lnc-nravmut的同时敲低il-6r的a549或beas-2b细胞感染rsv,感染后48h,收取细胞总rna,经qrt-pcr检测rsv相关基因相对表达量;收取细胞总蛋白,westernblot检测rsvf蛋白的表达量;收取细胞上清,病毒空斑试验检测细胞上清中rsv病毒滴度的变化情况。8敲低lnc-nrav、il-6r或敲低lnc-nrav的同时过表达il-6r的细胞感染rsv,感染后48h,收取细胞总rna,经qrt-pcr检测rsv相关基因相对表达量;收取细胞总蛋白,westernblot检测rsvf蛋白的表达量;收取细胞上清,病毒空斑试验检测细胞上清中rsv病毒滴度的变化情况。结果:1targetscan、mirdb和microrna三个数据库预测,mir-125a-5p与mir-125b-5p下游靶基因中交集度及评分值较高的有il-6r、irf4、il-31、cd5l、il-16、cxcl13。以qrt-pcr验证,il6-rct值为28-29,在a549和beas-2b细胞中有表达,其余基因ct值>40(undetected),在细胞中未检出。故后续试验围绕il-6r设计进行。2双荧光素酶报告试验结果提示,在细胞中lnc-nrav和il-6r均可竞争性地结合mir-125a-5p和mir-125b-5p。3lnc-nrav和il-6r的表达量呈正相关,均起到促进rsv病毒复制的作用:3.1过表达lnc-nrav组il-6r的相对表达量明显高于对照组(p<0.05),过表达lnc-nravmut组il-6r的相对表达量与对照组相比无明显差别(p>0.05)。在回复试验中,过表达lnc-nrav的同时过表达mir-125a-5p或mir-125b-5p,il-6r的相对表达量与对照组相比无明显差别(p>0.05)。3.2敲低lnc-nrav组il-6r的表达量明显低于对照组(p<0.05)。在回复试验中,同时敲低lnc-nrav、mir-125a/b-5p,il-6r的表达量回复至对照组水平(p>0.05)。3.3过表达mir-125a/b-5p组il-6r的表达量明显低于对照组(p<0.05)。在回复试验中,同时过表达mir-125a/b-5p与lnc-nrav,il-6r的表达量回复至对照组水平(p>0.05)。3.4在以上过表达细胞中感染rsv,结果显示,过表达lnc-nrav组、过表达il-6r组rsv相关基因、f蛋白表达量及上清中病毒滴度明显高于对照组(p<0.05),而过表达lnc-nravmut组则与对照组相比无明显差别(p>0.05);在回复试验中,过表达lnc-nrav的同时敲低il-6r,rsv以上指标与对照组相比无明显差别(p>0.05),而过表达lnc-nravmut的同时敲低il-6r,rsv的增殖明显低于对照组(p<0.05)。3.5在分别敲低lnc-nrav、il-6r的细胞中感染rsv,结果显示rsv相关基因、f蛋白的表达量及上清中病毒滴度均明显低于对照组(p<0.05);在回复试验中,敲低lnc-nrav的同时过表达il-6r,则rsv的增殖回复至对照组水平(P>0.05)。结论:1 RSV感染引起呼吸道上皮细胞lnc-NRAV的表达下降。2在呼吸道上皮细胞中上调lnc-NRAV能够促进RSV在其中的复制;下调lnc-NRAV则能够抑制RSV在宿主细胞中的复制。3 lnc-NRAV通过碱基互补配对方式结合miR-125a/b-5p,发挥“分子海绵”作用,进而影响病毒复制。4 lnc-NRAV与IL-6R具有相同的miR-125a/b-5p结合位点。在RSV感染的呼吸道上皮细胞中,lnc-NRAV通过与miR-125a/b-5p结合削弱了后者对IL-6R的负调节,促进了RSV病毒复制。