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对虾病害在世界范围的广泛传播,给水产养殖造成了重大损失。深入开展对虾免疫机制研究并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法已成为当务之急。Fortilin蛋白,一种多功能蛋白,具有参与细胞周期,钙结合活性以及抗凋亡等多种活性。并且,对虾fortilin蛋白参与抗病毒反应,对虾注射重组fortilin后,进行WSSV感染,存活率达80-100%,但是,口服重组fortilin组对虾攻毒后存活率仅为10%。药物注射费时费力,显然不适用于大规模对虾养殖,那么如何提高口服效用,以方便的饲用方式应用于实际生产是亟待解决的问题。本研究从提高fortilin蛋白的转运效率入手,选用细胞穿膜肽引导,试图为其应用寻找一种可行的方法。实验采用PCR方法构建了fortilin和穿膜肽TAT的融合基因,在毕赤酵母中进行融合蛋白的重组表达,并在体外和体内研究了融合蛋白对凡纳滨对虾免疫功能的影响。研究主要分为以下三个部分:1.首先,参照Genbank中基因序列设计引物,PCR扩增得到凡纳滨对虾fortilin目的基因片段。并且,直接在引物末端融合33个碱基对的TAT序列,通过PCR扩增将TAT序列引入到基因的末端。同时,以pTracer-CMV2质粒为模板扩增得到GFP基因片段。采用重叠延伸PCR的方法构建融合基因,Fortilin-GFP,GFP-Fortilin,TAT-Fortilin-GFP以及GFP-Fortilin-TAT用于后续穿膜研究;而Fortilin,TAT-Fortilin和Fortilin-TAT用于后续免疫活性研究。为了进一步构建重组质粒,在PCR扩增时引入限制内切酶EcoR I、Xba I识别位点,基因片段经双酶切插入表达载体pGAPZαA,转化大肠杆菌,经Zeocin抗性筛选及测序分析,获得重组表达载体,并确认所得到的融合基因与设计的基因序列完全一致,读码框正确。重组质粒经Avr II线性化后电击转化毕赤酵母X-33,Zeocin抗性筛选及酵母基因组PCR检测挑选阳性转化子,酵母转化子发酵后表达产物的上清液经SDS-PAGE电泳和质谱分析,均检测到目的蛋白,表明在酵母中成功表达目的融合蛋白。2.为方便细胞定位观察,本研究选择绿色荧光蛋白(GFP)作为分子标记实验利用GFP的自发荧光检测融合蛋白的穿膜效果。实验中将融合蛋白与血细胞共培养,结果显示,培养30min,就可以检测到细胞内绿色荧光,并且持续至24h,表明TAT有效携带fortilin穿透血细胞膜。并且,进一步的离体翻转肠囊实验发现,TAT-Fortilin-GFP、GRP-Fortilin-TAT可以穿透对虾离体肠壁。同时,TAT多肽融合于fortilin蛋白的C端和N端,均能促进其穿透生物膜,穿膜效率未见明显差异。TAT能够促进fortilin蛋白穿膜转运,那么又会对细胞活性产生怎样的影响呢?本实验选取了四种免疫相关酶指标,以体外原代培养的凡纳滨对虾血细胞来研究Fortilin,TAT-Fortilin和Fortilin-TAT重组蛋白的活性。结果发现,Fortilin,TAT-Fortilin和Fortilin-TAT显著增强了血细胞酚氧化酶(PO)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性(P<0.05),200、500μg/ml Fortilin,TAT-Fortilin和Fortilin-TAT处理组血细胞呼吸爆发活性显著升高(P<0.05),TAT-Fortilin和Fortilin-TAT融合蛋白显著提高了血细胞一氧化氮合酶(NOS)活性,仅500μg/ml Fortilin处理组NOS活力显著高于对照(P<0.05)。200μg/ml Fortilin-TAT处理组呼吸爆发和SOD活性显著高于同浓度Fortilin处理组(P<0.05);100、200μg/ml TAT-Fortilin和Fortilin-TAT处理组PO、NOS活性显著高于同浓度Fortilin处理组(P<0.05)。WSSV病毒刺激后,200μg/ml TAT-Fortilin和Fortilin-TAT处理组血细胞SOD活性,500μg/ml TAT-Fortilin处理组血细胞PO活性,500μg/ml Fortilin-TAT处理组血细胞NOS活性显著高于相同浓度TAT-Fortilin处理组血细胞相应酶活(P<0.05)。上述实验数据表明,Fortilin能够提高对虾血细胞免疫活性,并且TAT通过提高fortilin蛋白的转运而促进其作用的发挥。3.以凡纳滨对虾为研究对象,探讨在基础饲料中分别以酵母表达上清和酵母培养物两种形式添加融合蛋白对对虾生免疫及抗病力的影响。重组蛋白Fortilin酵母表达上清添加组对虾呼吸爆发、PO、NOS活性显著升高(P<0.05),同时,Fortilin-TAT酵母表达上清添加组四种酶活均显著增强,且显著高于Fortilin酵母表达上清添加组,结合前面的实验结果,推测Fortilin蛋白能够增强对虾免疫力,TAT通过有效转运Fortilin蛋白从而加强这种免疫增强作用。除呼吸爆发活性外,TAT-Fortilin酵母表达上清添加组酶活显著高于Fortilin酵母表达上清添加组,但其SOD、NOS酶活显著低于Fortilin-TAT酵母表达上清添加组,这个结果表明TAT融合于蛋白C端更利于其作用的发挥。另外,酵母表达上清及相对应的酵母培养物添加组之间酶活性基本无显著差异,说明以酵母表达上清或者酵母培养物任一形式添加均可以实现重组蛋白作用的发挥。病毒感染实验的数据基本与免疫酶活结果一致,饲料中添加重组蛋白Fortilin、TAT-Fortilin和Fortilin-TAT增强了对虾的免疫力,从而提高了WSSV感染后凡纳滨对虾存活率。Fortilin-TAT酵母表达上清添加组攻毒后存活率最高,TAT-Fortilin酵母表达上清添加组存活率次之,Fortilin酵母表达上清添加组存活率低于前两组,但各组之间存活率没有显著差异(P>0.05)。空质粒酵母添加同样提高了对虾病毒感染后的存活率,但差异不显著(P>0.05)。基于本文以上实验数据,可以得出以下结论:TAT可以有效引导fortilin蛋白穿透生物膜,从而促进其转运和吸收,进而加强fortilin作用的发挥,提高凡纳滨对虾非特异性免疫力,并保护对虾抵御WSSV病毒。以酵母为表达运载工具,融合TAT多肽以引导穿膜的这个系统,为活性蛋白在水产养殖中的应用开辟了一条新的途径。