论文部分内容阅读
AP-2转录因子家族是具有特异的DNA序列结合的蛋白，在多种组织和器官的发育和分化过程中发挥着重要作用。目前发现哺乳动物的AP-2家族有五个成员，分别是AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ和 AP-2ε，该家族在发育进化过程中对基因的表达有着非常重要的调控作用。AP-2δ蛋白是我们发现的一个位于染色体6p12-p21.1和AP-2β串连的家族新成员，由452个氨基酸残基组成，在DNA结合以及形成二聚体的区域与其它AP-2蛋白有很高的相似性，这正是AP-2家族蛋白的典型结构。但是AP-2δ蛋白有明显的不同，主要是AP-2δ缺乏Pγ结构和一些与转录调控活性有重要关系的保守氨基酸残基，尽管这样，AP-26蛋白仍然能正常发挥反式转录激活功能。AP-2δ拥有独特的结构和特异的表达谱，很有可能在哺乳动物发育过程中通过独特的机制而发挥独特的功能。RT-PCR 结果发现AP-2δ在成人脑、骨骼肌、胎盘、胸腺、小肠、睾丸和前列腺中的表达量较高。为了研究AP-2δ蛋白的功能，我们利用基因芯片方法，大规模筛选AP-2δ的转录调控基因。并通过实时定量PCR来验证芯片筛选的结果，发现AP-2δ能明显地调节基因ACE2、EIF4B、Cep290、MSN、RPL29、CAPNS1、HMOX1、ITSN1、LDOC1L、PDGFC和RPL29的表达。
双色荧光素酶报告检测系统检验的结果表明转染AP-2δ后的AD293 和NIH3T3 细胞能显著激活血红素加氧酶(HMOX1)的转录调控序列。因此我们主要研究AP-2δ对血红素加氧酶的转录调控序列的激活作用。
我们利用双色荧光素酶报告检测系统对血红素加氧酶的转录调控序列进行缺失研究，结果表明AP-2δ的作用位点位于上游转录调控序列-206bp-1bp 之间。接下来对该片断中存在的AP-2家族比较保守的一致性结合序列进行突变发现转录活性基本没有变化，因此我们初步认为AP-2δ有其特异性的结合位点。接下来我利用凝胶阻滞电泳实验实验确认AP-2δ的DNA结合序列，结果显示AP-26δ与AP-2家族的保守结合序列5’-GCCN<,3>GGC-3’不结合，但是可以与优化后的位点5’-GCCTGAGGC-3’特异性的结合。AP-2δ与AP-2家族成员转录激活位点特异性的不同，推测是因为它N端缺少一个PY结构域以及几个转录激活保守的关键氨基酸残基的差异，从而使其转录调控的作用机制有所不同，但是AP-2δ仍然具有比较强的转录活性。