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水蕨(Ceratopteris thalictroides(L.)Brongn.)广泛分布于长江以南各省区,根生于淤泥中。因其具有同型孢子和生长周期短的特点,成为蕨类植物学研究的模式植物。本研究以水蕨为材料,从中克隆了蓝藻抗病毒蛋白-N同源(Cyanovidn-N homology,CVNH)基因和血红蛋白基因的全长序列,通过进行基因序列分析和基因家族的分子进化研究,探讨了这两类基因在蕨类植物中的组成特征、结构形式以及它们所属基因家族的进化样式和进化方式。
蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CV-N)具有广谱抗病毒活性,其同源物构成CVNH蛋白家族。通过和公共数据库中的序列进行BLAST分析,发现CVNH结构域具有“零散分布(Patchy distribution)”的特点,即它在部分蓝藻、有纤丝的子囊菌和蕨类植物水蕨属植物(Ceratopteris richardii Brongn.)中存在,但在其他蓝藻、子囊菌和植物中却未曾出现。本研究采用寡核苷酸套式PCR(SON-PCR)、反向PCR(IPCR)和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法克隆了水蕨CVNH基因的全长序列。该基因全长为1993 bp,包含818 bp的5非编码区、452 bp的3非编码区和723 bp的编码区；其中编码区由3个外显子和2个内含子组成,编码150个氨基酸。预测的蛋白质(命名为CtCVNH)的等电点(PI)为4.47,分子量为15.9556 kDa。三维结构模拟表明CtCVNH具有同CVNH家族其他成员类似的三维结构,即是一个细长的、大的β-片层蛋白,形成了假二重对称的椭球状结构。但与天然的CV-N相比也存在一些差异,表现在:(1)加长的N-和C-端区域；(2)螺旋-转角区域由螺旋代替了在CV-N中的环(Loop)结构等。
为深入了解CVNH结构域的“零散分布”状况,通过重建基因树,发现它在真菌的黑曲霉、费氏曲菌、产黄青霉、粗糙脉孢霉,蓝细菌的蓝杆藻和蕨类植物水蕨等物种中存在多份拷贝。在此基础上,又分别采用机理式模型(Mechanisticmodel)和MEC模型(Mechanistic-empirical combination model)对CVNH结构域序列进行了适应性进化分析。结果显示,蓝杆菌菌株7822和7424的祖先分支经历了适应性进化,并且在该分支上鉴定出6个正选择位点(34L、63L、13H、76C、78K和80I)。
植物血红蛋白(Hemoglobin)是一类由珠蛋白(Globin)和血红素(Ferroheme)组成的结合蛋白,广泛存在于植物界。根据序列特征、表达模式及配基结合性质可将血红蛋白分为共生血红蛋白(Symbiotic hemoglobin,sHb)、非共生血红蛋白(Nonsymbiotic hemoglobin,NsHb)和截短的血红蛋白(Truncatedhemoglobin,tHb)三类。迄今已经在苔藓植物、裸子植物和被子植物中克隆到血红蛋白基因序列；但是,在蕨类植物中相关研究还未见报道。本研究采用TAIL-PCR方法克隆了水蕨血红蛋白基因的全长序列。该基因的序列总长为949 bp,包含4个外显子和3个内含子,编码189个氨基酸。预测的蛋白质(命名为CtHb)的分子量为21.1373 kDa,等电点(pI)为7.81。三维结构模拟表明CtHb具有植物血红蛋白典型的三级结构:即含有A、B、C、E、F、G和H螺旋,形成了3-on-3的“三明治”结构。和水稻血红蛋白的三级结构相比,CtHb的大部分结构(包括具有远端和近端组氨酸定位的E螺旋和F螺旋的位置等)同水稻的结构极为相似。两者的不同之处主要表现在:(1)CtHb含有较长的N-端区域；(2)两者CD-loop的折叠方式不同；(3)两者螺旋B和螺旋C的连接方式不同,CtHb是通过卷曲连接的,而水稻中借助的是螺旋。
通过对植物血红蛋白基因家族进行分子系统发育分析发现,通过基因重复在被子植物中产生了class1和class2两类血红蛋白基因。该基因重复发生在单、双子叶植物分化之前。可是,class2类基因在单子叶植物中发生了一次基因丢失事件,致使形成了现在的分布格局:即class1类基因广泛分布于单、双子叶植物中,而class2类基因则仅见于双子叶植物。通过计算相对进化速率和进行适应性进化分析,发现class2类基因的进化速率高于class1类基因,这在class2中的共生血红蛋白基因中表现尤其明显。分别在class2、sHbs的祖先支上检测到了正选择的发生,表明基因重复发生后,class2、sHbs通过插曲式进化和适应性进化获得了不同的功能。通过分析class1和class2的功能性分歧,检测到14个Ⅰ类功能性分歧位点,但是未能发现Ⅱ类功能性分歧位点。这些功能性分歧位点是由正选择作用或者放松的选择限制产生的。这些结果可以指导后续的实验工作,来验证那些具有重要功能的氨基酸置换位点和正选择位点,从而揭示功能性分歧和适应性进化的分子基础。